Гост определение крахмала в кормах: Вы точно человек?

Мы наблюдали 249 перекрывающихся коэкспрессируемых генов с уровнями фруктозы и глюкозы в зерне, хотя уровни фруктозы были примерно в три раза выше, чем уровни глюкозы при 7 и 14 DPA (рис. 1). Было 23 гена, координированно экспрессируемых как с сахарозой, так и с глюкозой, тогда как с сахарозой и фруктозой их не было. Трудно объяснить высокую корреляцию между транскриптами, которые имеют такой же профиль накопления, как уровни глюкозы и фруктозы, и разницу в количестве транскриптов, следующих за сахарозой / глюкозой (23), по сравнению с уровнями сахарозы / фруктозы (0).Наши результаты, возможно, означают, что метаболизм глюкозы, а не фруктозы, более точно отражает изменения в метаболизме сахарозы и крахмала. Это согласуется с тем, что крахмал является основным поглотителем сахарозы, а благодаря его активированной форме АДФ-глюкоза глюкоза является предшественником биосинтеза крахмала. Однако это не согласуется с отчетом о том, что глюкоза и фруктоза в равной степени способствуют метаболизму крахмала [28]. Существует очень мало исследований, которые показывают, в какой степени фруктоза является регулятором глобальной экспрессии генов в эндосперме злаков или в любом другом органе растения, а взаимосвязь сахаров с образованием крахмала требует дополнительных исследований [29].

3.1.2. Крахмал, амилоза и амилопектин

Накопление запасов в развивающемся зерновке показывает, что общий белок, общий крахмал и содержание амилозы (рис. 2 (а)) стабильно накапливаются от 10 DPA до пика при 35 DPA, за которым следует небольшое снижение при 50 DPA. Количество крахмала, которое накапливается в виде амилозы, увеличилось с 7 до 35 DPA развития. Изменение содержания амилозы в зерновке коррелировало с изменениями распределения гранул во время созревания зерна (см. Ниже) и транскриптами основных запасных белков семян, включая α — и γ -глиадины (Таблица

Физико-химическая и морфологическая характеристика картофельного крахмала Модифицировано бактериальными амилазами для применения в пищевой промышленности

Два мультиферментных бактериальных препарата α -амилазы Bacillus licheniformis и амилозубтилин® были использованы для модификации картофельного крахмала при различных концентрациях ферментов.Получено восемь типов крахмала, изучены их морфологические, функциональные и физико-химические характеристики. Индукция ферментных препаратов позволила получить крахмалы, обладающие повышенной растворимостью и водопоглощающей способностью, а также более низкими температурами и вязкостью гелеобразования. Было обнаружено, что изученные амилолитические препараты действительно по-разному влияют на гранулы крахмала, несмотря на идентичные основные активности амилазы. Сочетание изученных характеристик ферментативно модифицированных крахмалов делает их перспективными для использования в качестве компонента пищевых систем, требующих корректировки их текстурных особенностей.

1. Введение

В современной пищевой промышленности обычно используются некоторые функциональные пищевые добавки, в том числе модифицированные крахмалы, которые обладают высокой способностью удерживать влагу и придают конечному продукту желаемую консистенцию и консистенцию. Каждая пищевая добавка имеет свои преимущества и недостатки, знание которых позволяет нам достичь наилучших результатов при использовании таких добавок в определенных условиях обработки.

Картофель, кукуруза, пшеница, рис, тапиока и некоторые другие крахмалы используются для получения модифицированных крахмалов.В процессе обработки крахмалы обрабатываются физическими, химическими или ферментативными методами [1, 2].

Различия в свойствах крахмалов проявляются в зависимости от источника и генотипа. Свойства крахмала в основном зависят от их физических и химических характеристик, среднего размера гранул, процента распределения групп гранул разного размера, соотношения амилоза / амилопектин и их минерального содержания [3]. Форма и размер гранул крахмала являются характеристиками их ботанического происхождения.Форма гранул может варьироваться от абсолютно сферической и округлой до овальной [4, 5].

По изменениям, происходящим в нативных крахмалах, можно выделить пять основных модификаций: предварительное желатинирование, деполимеризация, окисление, стабилизация (без сшивания полимерных цепей) и образование сшитых крахмалов [1].

Картофельный крахмал — один из наиболее распространенных полисахаридов, используемых в качестве загустителей и стабилизаторов в пищевых системах. Картофельный крахмал исторически наиболее широко использовался в производстве колбас, в основном из-за его низкой температуры желатинизации.Учитывая, что пастеризация колбас происходит при относительно низкой температуре (70–72 ° C), всегда существует риск того, что гранулы любого другого крахмала не смогут желатинизироваться в таких условиях и эффективно связывать воду [6]. Для картофельного крахмала разница в гранулированной структуре крахмала от одного сорта к другому намного выше. Установлено, что в картофеле размеры гранул крахмала находятся в широком диапазоне: от нескольких микрон в диаметре для мелких гранул до 110 мкм мкм для крупных [7].

Исследования различных фракций картофельного крахмала разных сортов показали общее правило для содержания амилозы: самая высокая концентрация амилозы была обнаружена во фракции с высокомолекулярными гранулами, а более низкая — во фракции со средними молекулярными гранулами, и самый низкий — с низкомолекулярными гранулами [8]. Аналогичная тенденция была обнаружена при анализе желатинизирующей способности фракций и индексов вязкости.

Хорошо известно, что желирующие свойства гранул высокомолекулярного и низкомолекулярного крахмала, полученных из разных сортов картофеля, имеют разные температурные профили желатинизации [9].Фракция мелких гранул крахмала имеет более высокое содержание фосфора, чем более крупные гранулы [10, 11]. Физические и химические свойства, такие как светопропускание, содержание амилозы, способность набухать и водопоглощающая способность, сильно коррелируют со средним размером гранул крахмала, извлеченного из различных сортов картофеля [12, 13].

Помимо способности к гелеобразованию и набуханию, важно, чтобы крахмалы, используемые в пищевой промышленности, могли удерживать воду в течение всего процесса пастеризации и желаемого срока хранения.Для нативного картофельного крахмала это на самом деле нереальная задача. Однако ее можно решить с помощью модифицированных крахмалов. Модифицированные крахмалы с разными температурами желатинизации могут использоваться как в низкотемпературных процессах, таких как пастеризация колбас, так и в процессах стерилизации, таких как стерилизация мясных консервов. Поскольку в данном случае биологическая модификация столь перспективна и необходимо получить безопасный продукт, картофельный крахмал был модифицирован двумя полиферментными бактериальными препаратами с ведущей амилазной активностью.Изучены физико-химические, функциональные, технологические и морфологические параметры крахмалов.

2. Материалы и методы

2.1. Ферментные препараты

2.1.1. Получение α -амилазы Препарат Bacillus licheniformis

Мы используем среду, оптимизированную для синтеза α -амилазы: кукурузная мука: 8%; пшеничная мука: 8%; кормовые дрожжи: 3%; MgSO ₄ × 7H ₂ O: 0,2%; и CaCO ₃ : 0,25%. Уровень pH среды перед стерилизацией был равен 8.0–8,2. Штамм культивировали в колбах объемом 750 мл с 30 мл ферментационной среды на качалке (240 об / мин) при 37–43 ° С в течение 48–144 ч. Препарат получали путем отделения биомассы клеток-продуцентов от ферментационного бульона с использованием центрифугирования при 8000 об / мин в течение 10 мин. В ферментационном бульоне активность α -амилазы составляла 250 Ед / мл при 40 ° C.

Амилосубтилин ® (Бердский завод биопрепаратов (ныне Сиббиофарм), Россия) получают сушкой ферментационного бульона при глубинном культивировании Bacillus subtilis .Это однородный гигроскопичный водорастворимый порошок светло-бежевого или светло-серого цвета. Амилозубтилин G3X состоит из следующих ферментов: α -амилаза: 1000–1600 Ед / г, глюкоамилаза: до 100 Ед / г, β -глюканаза: до 500 Ед / г, целлюлаза: до 30 Ед / г г, ксиланаза: до 10 Ед / г и нейтральная протеаза: до 20 Ед / г. Его амилолитическая активность составляет 1000 Ед / г. Оптимальные условия для его деятельности: pH = 4,5–7,0 и температура 30–50 ° C.

2.1.2. Определение активности амилазы

Объем 0.5 мл субстрата (1% растворимого крахмала в ацетатном буфере) при 50 ° C добавляли в пробирку, содержащую 0,5 мл фермента (ферментационный бульон), на 30 минут. Затем добавляли 450 мкл мкл 3,5-динитросалициловой кислоты (DNSA) (буфер для удаления ингибитора). Готовили 0,5 г буфера для удаления ингибитора. DNSA растворяли в 30 мл H ₂ O при 50 ° C, добавляя 5 мл раствора Na и K (8 г NaOH + 11,2 г KOH, растворенных в 50 мл H ₂ O) и 5 ​​мл. мл раствора (15 г тартрата Na, K в 50 мл H ₂ O).Смесь инкубировали на кипящей водяной бане при 100 ° C в течение 5 минут и охлаждали при 0 ° C в течение 5 минут. Добавляли 4,5 мл дистиллированной воды. Затем образец измеряли при 540 нм. Контрольный образец готовили следующим образом: контрольные пробирки, содержащие 0,5 мл субстрата (1% растворимого крахмала в ацетатном буфере), инкубировали при 50 ° C в течение 30 минут. Добавляли 450 мкл мкл DNSA (буфера для удаления ингибитора). Затем добавляли 0,5 мл ферментационного бульона, инкубировали на кипящей водяной бане при 100 ° C в течение 5 минут и охлаждали при 0 ° C в течение 5 минут.Затем добавляли 4,5 мл дистиллированной H ₂ O. Результат оценивали с помощью калибровочной кривой редуцирующих сахаров (глюкозы).

2.2. Модификация крахмала

Крахмал картофельный нативный (по ГОСТ Р52791-2007). Модификация этого крахмала была основана на применении амилозубтилина® (AM) и амилазы из Bacillus licheniformis (Bl) в различных концентрациях (таблица 1). Модификацию проводили в воде (30 г / 100 мл), pH = 7, 40 ° C в течение 1 часа.Реакцию гидролиза останавливали добавлением концентрированной серной кислоты (pH = 2). Затем крахмал отделяли от жидкости фильтрацией и сушили при 40 ° C. Крахмалы были использованы для дальнейших исследований.

2.3. Анализ физико-химических свойств крахмалов

Содержание амилозы определяли методом связывания йода, описанным Williams et al. [14]. Количество белка измеряли по методу, описанному Брэдфордом [15]. Определение остаточного редуцирующего сахара анализировали с помощью метода 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS) [16].Влажность крахмала определяли сушкой при 105 ° C в течение 2 ч.

Водопоглощающая способность (WAC) и индекс водорастворимости (WSI) были описаны Omojola et al. [17], которые используются для определения WAC и WSI. Образец крахмала (5% мас. / Об.) Диспергировали в предварительно взвешенной центрифужной пробирке. Пробирку помещали в вихревой смеситель на 2 минуты, оставляли при комнатной температуре на 30 минут, осторожно перемешивали в течение этого периода и затем центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 минут. Затем супернатант сливали и измеряли вес пробирки и гидратированного образца.Вес был рассчитан и выражен как вес воды, связанной 100 г сухого крахмала.

Индекс растворимости в воде [17] определяет количество полисахаридов или высвобождение полисахаридов из гранул при добавлении избытка воды. WSI — это масса сухих твердых веществ в супернатанте из теста WAC. Затем надосадочную жидкость декантировали в тарированную чашку для выпаривания известного веса. Регистрировали вес высушенного твердого вещества после испарения в печи с циркуляцией воздуха при 103 ° C.WSI (выраженный в граммах твердых веществ / 100 г крахмала) рассчитывали по массе сухих твердых веществ, извлеченных путем выпаривания супернатанта при 110 ° C в течение 12 часов. Определения производили в трех экземплярах.

Температуру желатинизации оценивали с использованием метода Attama et al. [18]. Образец крахмала (1 г) помещали в химический стакан на 20 мл и добавляли 10 мл дистиллированной воды. Дисперсию нагревали на горячей плите. Затем температуру желатинизации измеряли термометром, подвешенным в суспензии крахмала.

2.3.1. Динамическая вязкость

Вязкость оценивали для 1% раствора крахмала, предварительно желатинизированного и охлажденного до 20 ° C, на стеклянном капиллярном измерителе вязкости ВНЖ (Россия), отслеживая время истечения крахмального геля.

2.4. Морфология и размер гранул

2.4.1. Оптическая микроскопия

Морфологию суспензий крахмала изучали с помощью светового микроскопа Axio Imager.Z2m (Carl Zeiss). Тонкий слой пасты готовился на предметном стекле и окрашивался раствором йода.Гранулы фотографировали с помощью камеры Nikon, прикрепленной к микроскопу.

2.4.2. Сканирующая электронная микроскопия (SEM)

Образцы крахмала закрепляли на металлических стержнях и покрывали сплавом золото-палладий (толщиной ∼15 нм) с использованием вакуумной машины для нанесения покрытий Quorum Q150T ES. Затем образцы наблюдали с помощью автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа Merlin (Carl Zeiss, Германия) при потенциале ускорения 15 кВ, детектор вторичных электронов. Снимки были сделаны с помощью программного обеспечения автоматического захвата изображений (Hitachi High-Technologies, Плезантон, Калифорния).Увеличение указано внизу каждого рисунка.

Полученные микроизображения использовались для обнаружения любых повреждений гранул крахмала и определения их формы.

2.4.3. Размер гранул

Влияние ферментативной обработки на размер крахмала изучали методом динамического светорассеяния (DLS) с использованием метода с использованием анализатора размера частиц и дзета-потенциала серии Zetasizer Nano-ZS (Malvern, Великобритания) при 25 ° C. Для этого были приготовлены растворы крахмала в диметилсульфоксиде 0,5 г · л ⁻¹ .Определен гидродинамический радиус D _h частиц через 24 ч экспозиции при температуре окружающей среды.

2,5. Термогравиметрический анализ (ТГА) и дифференциальный термический анализ (ДТА)

Кривые ТГ и ДТ были записаны с использованием системы одновременного действия TG 60 (Shimadzu) в потоке воздуха 100 мл · мин ^-1 и скорости нагрева 10 ° C · мин ^-1 . Начальная масса образца составляла около 9 мг. Тигли из глинозема использовались для экспериментов ТГ и ДТА.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Свойства ферментированных модифицированных картофельных крахмалов

Процент амилозы в крахмале под действием фермента Amylosubtilin® снижается на 6–11%, причем наибольшее снижение наблюдается для образцов, обработанных наибольшей или наименьшей концентрацией фермента (Таблица 2). После обработки крахмалов амилазой Bacillus licheniformis относительное содержание амилозы увеличилось на 1–3% в трех образцах и снизилось на 6% в крахмале, обработанном наибольшей концентрацией фермента (Bl-1).

Содержание свободных восстанавливающих сахаров во всех исследуемых образцах было выше, чем в нативном крахмале. В то же время это значение было выше в образцах, обработанных амилозубтилином, чем в образцах, обработанных ами.

Приготовление и характеристики эфиров крахмала и его влияние на физико-химические свойства теста

В качестве перерабатываемого природного материала крахмал является важным сырье в пищевой и других сферах.Натуральный крахмал путем этерификации может улучшить характеристики исходного крахмала и расширить область его применения. В этой статье рассматривается процесс получения ацетилированного адипата дистахмала, октенилсукцината крахмала, ацетата крахмала, гидроксипропилкрахмала и фосфата крахмала, а также исследования влияния сложных эфиров крахмала на тесто. В то же время он прогнозирует тенденции сложных эфиров крахмала и перспективы применения в будущих исследованиях.

1. Введение

Крахмал — это натуральный, возобновляемый, биоразлагаемый полимер, богатый ресурсами, которые широко встречаются в различных растениях.Многие из его уникальных физико-химических свойств широко применяются в пищевой и других отраслях промышленности [1, 2], но большая часть самого нативного крахмала не может использоваться напрямую [3]. После модификации свойства крахмала улучшаются и могут соответствовать требованиям многоуровневой обработки.

Этерификация — один из эффективных способов денатурации, и крахмал можно модифицировать физическими, химическими или ферментативными методами, которые эффективно применяются в пищевой, текстильной, бумажной, нефтехимической и фармацевтической промышленности в зависимости от его различных свойств.Применение сложного эфира крахмала в зарубежных странах было раньше, и налажено крупномасштабное промышленное производство. Некоторые сложные эфиры крахмала для пищевых продуктов в основном включают ацетат крахмала, ацетилированный адипат крахмала, октенилсукцинат крахмала, фосфат монокрахмала, фосфат крахмала, фосфат фосфат крахмала, фосфат ацетилированного крахмала, фосфат гидроксипропилкрахмала и гидроксипропилкрахмал в США, 5 странах ЕС [4, 5] ]. Хотя исследования в Китае проводятся относительно поздно, исследования и разработка сложных эфиров крахмала постепенно развивались в последние два десятилетия.В настоящее время сложные эфиры крахмала в качестве пищевых добавок в основном включают фосфатный дистрахмал, ацетатный крахмал, фосфат натрия крахмала, ацетилированный адипат дистахмала, фосфорилированный фосфат дистрахмала, ацетилированный фосфат дистхмала и фосфат гидроксипропилдихала в Китае [6]. Поскольку многие ученые уже исследовали процесс приготовления, технология синтеза в основном была сосредоточена на увеличении степени замещения (DS), которая определила направление применения этерифицированного крахмала [7, 8]. Ниже приводится сводка обычных сложных эфиров крахмала органических кислот и сложных эфиров крахмала неорганических кислот (таблица 1).

2.Получение сложных эфиров крахмала и свойства

2.1. Ацетилированный адипат дистахмала

Ацетилированный адипат дистрахмала (ADiSP) представляет собой сшитый композитный модифицированный крахмал, полученный этерификацией крахмала адипиновой кислотой и уксусным ангидридом. Продукт имеет характеристики сшитого и этерифицированного крахмала, а также термостойкость, высокое сопротивление сдвигу и кислотостойкость. Ацетилированный адипат дистахмала может быть использован в качестве загустителя, стабилизатора и связующего в пищевой промышленности [9].Ацетилированный фосфат дистрахмала — это модифицированный крахмал, который используется в некоторых продуктах для детского питания. Биодоступность ADiSP и нативного (немодифицированного) крахмала оценивалась у 20 здоровых младенцев и 21 малыша в возрасте 8–24 мес. С хронической неспецифической диареей [10].

Ацетилированные, сшитые и прежелатинизированные крахмалы из маниоки были произведены в одношнековом экструдере с различным содержанием влаги (180, 220 и 260 г / кг), различными концентрациями смешанного ангидрида адипиновой уксусной кислоты (4, 11 и 18 г). / кг) и скорости шнека (100, 130 и 160 об / мин).Стадии ацетилирования, сшивания и предварительного желатинизации увеличивают вязкость на холоду, индекс водопоглощения и твердость геля, а также снижают когезионную способность геля, прозрачность пасты и ретроградацию полученных крахмалов. Продукты, изготовленные в менее жестких условиях эксплуатации (влажность 260 г / кг и скорость вращения шнека 100 об / мин) и при более высокой концентрации реагентов (18 г / кг), имели основную группу функциональных характеристик, предпочтительных для пудингов, десертов быстрого приготовления и пищевых продуктов, подвергшихся воздействию низкотемпературное хранение.При использовании 260 г / кг влаги, концентрации реагента 11 г / кг и скорости вращения шнека 160 об / мин крахмальные продукты давали высокую прозрачность и отсутствие синерезиса, и их можно было использовать в начинках для фруктовых пирогов, супах и консервированных продуктах [11].

Ацетилированный адипат дистрахмала тапиоки был получен путем ацетилирования и реакции сшивания с использованием крахмала тапиоки в качестве сырья и смеси уксусного ангидрида и адипиновой кислоты в качестве агента для ацеталирования и сшивания, соответственно, и мокрым способом. Систематически изучалось влияние факторов модификации, таких как количество уксусного ангидрида и адипиновой кислоты, значение pH и время реакции на реакции этерификации.Оптимальные условия, необходимые для получения ацетилированного адипинат дистрахмала тапиоки, были 0,050% адипиновой кислоты, 3% уксусного ангидрида, pH 8,0 и 90 мин. Пиковая вязкость и холодная вязкость ацетилированного тапиокового адипината дистахрама составляли 1141 BU и 1695 BU, соответственно, что было выше, чем у нативного крахмала тапиоки. Температура желатинизации ацетилированного адипата дистахрама тапиоки снизилась, но стабильность вязкости повысилась. Сопротивление сдвигу и стабильность при замораживании-оттаивании были значительно улучшены, но прозрачность снизилась [12, 13].

2.2. Крахмал-октенилсукцинат натрия

Крахмал-октенилсукцинат натрия — один из наиболее широко используемых сложных эфиров крахмала. Впервые он был успешно синтезирован Колдуэллом и Вюрцбургом в США и запатентован в 1953 г. [14]. Крахмал-октенилсукцинат натрия — одна из ранее использовавшихся пищевых добавок и своего рода безопасный и надежный загуститель эмульгатора. Когда октенилянтарный ангидрид реагирует с крахмалом, кольцо ангидрида открывается в щелочных условиях: один конец которого соединяется с гидроксидом натрия с образованием натриевой соли, а другой конец реагирует с крахмалом и удаляет одну молекулу воды.PH всей реакции непрерывно снижается по мере протекания реакции, поэтому он непрерывно нейтрализуется щелочным раствором, чтобы обеспечить pH всей реакционной системы, так что реакция протекает эффективно. Поскольку реакция этерификации и реакция гидролиза протекают одновременно, реакция этерификации преобладает в начале реакционной фазы, и реакция переходит в реакцию этерификации; когда время реакции достигает определенного времени, реакция гидролиза будет доминирующей из-за уменьшения концентрации субстрата, поэтому время реакции не настолько велико, насколько это возможно, поэтому вы должны контролировать время реакции.Для получения октенилсукцината крахмала существуют в основном мокрый, сухой и физический методы экструзии [15].

Конкретная операция синтеза заключается в размещении определенной концентрации суспензии в реакционном сосуде и использовании 2% раствора NaOH для регулирования pH раствора крахмала. Обработанный крахмал-октенилсукцинат натрия медленно добавляли к смешанному раствору по частям, поддерживая pH системы на уровне 8,0 ± 0,2 во время добавления. По окончании реакции pH реакционной смеси снова доводили до 6.5 с использованием 2% HCl. Полученный продукт промывали и центрифугировали, трижды сушили в сушильном шкафу при 45 ° C и сушили с получением крахмала октенилсукцината [10]. Таким образом, Yoshimura et al. [16] использовали метод органической фазы для синтеза октенилсукцината крахмала с использованием 4-диметиламинопиридина (DMAP) в качестве катализатора этерификации и диметилсульфоксида в качестве растворителя.

В сухом методе крахмал смешивается с щелочью, распыляется вода до 25% содержания воды в крахмале, распыляется ангидрид, разбавленный органическим растворителем, вступает в реакцию после смешивания, или крахмал сначала суспендируется в растворе с массовой долей , а затем фильтруют до тех пор, пока крахмал не высохнет до требуемой влажности, и распыляют на ангидрид, разбавленный органическим растворителем и нагретый в сухом смесителе.Этот метод позволяет процессу быть простым, высокоэффективным и недорогим, но неоднородным и легко приводит к местной бурной реакции [17].

В обычном влажном методе (метод водной фазы) степень замещения и эффективность этерификации зависят от типа крахмала и параметров реакции, и на них также влияет структура поверхности гранул крахмала. Из-за низкой растворимости крахмала октенилсукцината натрия в воде реакция этерификации с крахмалом в основном происходит на поверхности частиц, и легко возникают такие проблемы, как неравномерное распределение ангидрида кислоты и низкая эффективность реакции.С другой стороны, использование гидроксида натрия, пиридина и ангидрида при высокой температуре часто приводит к образованию других побочных продуктов в процессе химической реакции [18]. В последние годы за счет совершенствования традиционной синтетической технологии была предпринята попытка достичь более высокой эффективности и степени замещения за более короткое время. Основные методы включали механическую активацию, микроволновые и ферментативные методы. Ферментативный метод позволяет реализовать реакцию в мягких условиях и является экологически чистым.Кроме того, благодаря высокой эффективности фермента скорость реакции может быть значительно повышена, а качество продукта также может быть улучшено. Этерификация, конъюгированная с липазой, может резко снизить время реакции с нескольких часов до 30 минут, и это делает биоферментный метод технически осуществимым в крупномасштабном производстве крахмала октенилсукцината [19]. Xu et al. [20] исследовали высокоскоростной синтез OS-крахмала с помощью сдвига и охарактеризовали его модифицированные свойства. По сравнению с контрольным образцом DS крахмала увеличилась с 0.0182 до 0,0202, также улучшились термическая стабильность, прозрачность и стабильность при замораживании-оттаивании. Высокоскоростной сдвиг ослабляет кристаллические области гранул крахмала без изменения типа кристаллизации, в то время как эффект кавитации увеличивает площадь реакции за счет разрушения поверхности гранул, а также способствует уменьшению размера капель и равномерности распределения октенилсукцината натрия крахмала. , заставляя больше групп ОС индуцироваться во внутренние области крахмалов [21].

2.3. Ацетат крахмала

Ацетат крахмала получают путем введения ацетильной группы в атом водорода гидроксильной группы глюкозы. Ацетат крахмала можно разделить на высокую (1,5–3), среднюю (0,2–1,5) и низкую степень замещения (0,01–0,2). Слабозамещенный ацетилированный крахмал широко используется в пищевой промышленности в качестве загустителя или стабилизатора. Однако ацетилированный крахмал со средней и высокой степенью замещения имел высокую растворимость в ацетоне и хлороформе и в основном использовался для исследования и разработки термопластичных материалов и биоразлагаемых материалов [22].

Приготовление агента этерификации ацетата крахмала, в основном, включает уксусный ангидрид, винилацетат, винилхлорид, кетен и так далее. В химическом синтезе в качестве этерифицирующих агентов обычно предпочтительны уксусный ангидрид и винилацетат. В текущем промышленном производстве в большинстве способов синтеза в качестве катализатора реакции крахмала и ангидрида в щелочной водной суспензии выбирается NaOH [23].

Суспензию крахмала конфигурировали и встряхивали при 1500 об / мин в течение 1 ч при 25 ° C. PH суспензии крахмала доводили до 8.0 с 3% NaOH и медленно добавляли уксусный ангидрид. Во время добавления pH всегда поддерживали от 8,0 до 8,4. После завершения добавления уксусного ангидрида реакцию продолжали в течение 15 минут. PH доводили до 4,5 с помощью раствора HCl 0,5 моль / л, и суспензию после остановки реакции центрифугировали в течение 3 минут, последовательно промывали этанолом и, наконец, сушили в печи при 40 ° C, получая ацетат крахмала [24 ].

Тупа и др. [25] использовали новый гетерогенный подход, катализируемый органическими кислотами, для синтеза сложных эфиров крахмала, и в нем используется нетоксичный зеленый катализатор — винная кислота в отсутствие растворителя.Volkert et al. использовали различные методы синтеза для сравнения механических свойств ацетата крахмала, полученного путем добавления трех различных активаторов уксусной кислоты, гидроксида натрия и карбоната калия [26]. Колусси и др. сделал различные степени ацетилирования рисового крахмала с высоким, средним и низким содержанием амилозы. Результаты показали, что рисовый крахмал с низким содержанием амилозы легче ацетилируется, а DS выше, чем у амилозы с высоким и средним содержанием при тех же условиях и в разное время реакции [27].

Физические вспомогательные методы получения ацетата крахмала в основном включают синтез с помощью микроволн и механическую активацию. Микроволновая обработка подверглась всесторонним исследованиям за последнее десятилетие. Микроволновое нагревание может преодолеть ограничения, связанные с трудоемкостью и низким уровнем замещения при однократном ацетилировании. При условии сохранения целости гранул крахмала это вызывает шероховатость поверхности и внутреннее разрушение частиц, способствуя степени ацетилирования [28]. Импульсное электрическое поле (PEF), которое считается новым методом, аналогично применялось к процессу ацетилирования.Hong et al. исследовали, что обработка PEF способна повысить скорость этерификации за короткий период времени при соответствующих условиях. Это было связано с разностью потенциалов и переменным направлением электрического поля. Система PEF будет увеличивать скорость миграции и направление реакционных ионов, а также эффективное столкновение между ионами, что ускоряет скорость реакции и увеличивает DS. Таким образом, умеренная концентрация крахмала (35%) и высокая напряженность электрического поля более способствовали образованию ацетата крахмала с высоким DS [29].

2.4. Гидроксипропилкрахмал

Реакция крахмала с этерифицирующим реагентом, оксидом пропилена, приводит к введению гидроксипропильной группы в полимерную цепь крахмала. Выравнивание полимеров, которое вызывает изменение структуры пищевого продукта, приводит к непрозрачной, гелеобразной и / или комковатой текстуре с «просачиванием» жидкости из геля. Это называется ретроградацией и нежелательно во многих пищевых приложениях [30]. Процесс этерификации в основном делается для подавления ретроградации [31].Реакционная природа оксида пропилена обусловлена ​​его сильно напряженным трехчленным эпоксидным кольцом. Углы связи в кольце составляют в среднем 60 ° C, что приводит к очень нестабильной (реактивной) молекуле.

В реакциях замещения путем этерификации молекула крахмала сначала должна быть активирована, чтобы сделать связь O-H нуклеофильной и облегчить образование крахмала-O ^—. Щелочные реагенты в этом отношении превосходны в качестве катализаторов. Затем следует реакция крахмала-O ^— и оксида пропилена, которая приводит к бимолекулярному замещению с образованием гидроксипропилкрахмала [32].Эффективность гидроксипропилирования сильно зависит от используемых реагентов. Этерификация происходит в основном в аморфной области крахмальных гранул. Сообщается, что он влияет на конформацию молекул амилозы, и, как известно, на поверхности гранул появляются дырки [33]. Эффективность реакции определяется как процент реагента, прореагировавшего или замещенного на крахмал. Оставшийся реагент расходуется на образование побочных продуктов. Эффективность зависит от диффузии или проникновения щелочного катализатора и этерифицирующего агента в гранулы крахмала и от вероятности столкновений нуклеофила алкоголятов крахмала с молекулой пропиленоксида.Повышенная температура реакции способствует диффузии щелочного катализатора и более легкому проникновению этерифицирующего реагента в точку реакции внутри крахмальных гранул и, таким образом, снижает расход реагента.

Получение гидроксипропилкрахмала из различных источников зернового крахмала, таких как рис [34], пшеница [35, 36], кукуруза [37], источники клубневого крахмала, такие как картофель [38], и источники крахмала бобовых, например, полевой горох [ 39] не поступало. Был разработан ряд запатентованных способов получения простых эфиров гидроксиалкилкрахмала с низким содержанием заместителей в водной фазе.Высокие уровни замещения можно получить в гранулированном крахмале при использовании неводной среды или в сухих условиях [40].

Ким и др. приготовили гидроксипропилкрахмал и сравнили эффекты глицерина, сорбита и ксилита на крахмальную пленку. Оказалось, что лучшим пластификатором был 20% глицерин. После гидроксипропилирования хрупкость крахмальной пленки снижается [41]. Кукурузный крахмал с гидроксипропилглютеном был приготовлен с использованием пропиленоксида в качестве этерифицирующего агента, и было обнаружено, что термическая стабильность, кислотостойкость и прозрачность крахмала повышались по мере увеличения степени замещения.Гидроксипропилкрахмал имеет присоединенную к нему гидроксипропильную группу, которая препятствует полимеризации водородных связей молекул крахмала, что вызывает снижение температуры клейстеризации крахмала, повышение стабильности пастообразной жидкости, улучшение прозрачности, механическую прочность крахмальная пленка должна увеличиваться, а барьерные свойства должны быть улучшены [42].

2,5. Фосфат крахмала

Фосфат крахмала представляет собой этерифицированный крахмал, полученный после фосфорилирования.В настоящее время существуют в основном сухие, влажные и полусухие методы получения фосфата крахмала в стране и за рубежом. В сухом процессе определенное соотношение фосфата и раствора мочевины доводили до pH, а затем равномерно распыляли на сухой крахмал, чтобы уменьшить влажность в сушильной печи, чтобы нагреть реакцию с получением фосфата крахмала. Влажный процесс, принятый в традиционном промышленном производстве, позволяет использовать фосфорилирующие агенты (ортофосфат, метафосфат, оксихлорид фосфора и т. Д.,) для добавления к суспензии крахмала или реакции в органических растворителях. Ландерито и Ван [43] исследовали, что фосфорилирование может увеличивать вязкость крахмала и способность связывать воду. При обычном фосфорилировании может образовываться монозамещенный фосфатный моноэфирный крахмал или сшитый фосфодиэфирный крахмал. Тип и соотношение продукта зависели в основном от используемого фосфорилирующего агента, концентрации, pH и условий реакции. В водной среде фосфатный моноэфирный крахмал легко образовывался в мягких кислотных условиях, а сшитый фосфодиэфирный крахмал образовывался в щелочных условиях [44, 45].

Для мокрого синтеза фосфат натрия сначала растворяли в деионизированной воде, pH доводили до 6 или 8,5 с помощью 10 M NaOH и добавляли воду до 100 мл. Добавляют соответствующее количество крахмала, перемешивают до тех пор, пока он не станет вязким, и дают ему уравновеситься в течение 4 часов. Смесь сушили в сушильном шкафу при 50 ° C в течение ночи, а затем реагировали при 140 ° C в течение 4 часов. Непрореагировавший фосфат натрия экстрагировали горячим водным раствором этанола и собирали осажденный крахмал. Дистиллированную воду промывали и сушили несколько раз с получением фосфатного моноэфира крахмала [46].Przetaczek-Roznowska и Fortuna [47] приготовили фосфаты крахмала в щелочных условиях со смесью триполифосфата натрия, триметафосфата натрия, сульфата натрия и тыквенного крахмала и изучили влияние различных температур этерификации (115 ° C и 145 ° C) и продолжительности фосфорилирование на характеристики клейстеризации крахмала и реологию. Несмотря на то, что мокрый процесс продолжается уже много лет и технология является зрелой, у него были недостатки, связанные с загрязнением сточных вод, высоким потреблением энергии и высокой стоимостью промышленного производства.

В последние годы полусухое приготовление стало предметом исследований. Ларс Пассауэр и др. [45] довели pH раствора дигидрофосфата натрия и гидрофосфата натрия до pH 5 с помощью гидроксида натрия, добавили крахмал к смеси, перемешали и отфильтровали под вакуумом. После этого осадок на фильтре измельчали ​​при 55 ° C и сушили в течение 24 ч. Гомогенизированную смесь снова сушили при 65 ° C в течение 90 минут и реагировали при 150 ° C в течение 3 часов. После охлаждения до комнатной температуры непрореагировавшие продукты разложения фосфата и крахмала удаляли 50% -ным раствором метанола.Отфильтрованный продукт обезвоживали промыванием абсолютным этанолом и сушили с получением фосфата крахмала.

Кроме того, использование экструзии позволяет избежать таких проблем, как затраты времени на эффективность и рабочие операции в обычном процессе. В то же время высокая температура, высокое давление и сила сдвига в сухом состоянии в процессе экструзии также могут способствовать фосфорилированию крахмала. Маной и Ризви [48] разработали сверхкритическую жидкостную экструзию (SCFX) с использованием сверхкритического CO ₂ (SC-CO ₂ ) в качестве вспенивающего агента при постоянной скорости вращения шнека 120 об / мин, температуре 60–70 ° C и давление 10–15 МПа.В общем, физическая экструзия дешевле и более рентабельна, чем обычное нагревание в печи.

3. Влияние различных эфиров крахмала на свойства теста

Крахмал может разбавлять глютен в тесте до необходимого уровня, смешиваться с глютеном и поглощать воду из глютена путем желатинизации. Функциональность сырого крахмала имеет множество недостатков, и его качество напрямую влияет на качество макаронных изделий. Эфиры крахмала — безопасные и надежные пищевые добавки, а также улучшители качества теста.Добавление различных сложных эфиров крахмала может улучшить дефектные свойства исходного крахмала [49]. Комбинируя белки, улучшились технологические характеристики клейковины, характеристики обработки теста и газоудерживаемость, а улучшенные макаронные изделия стали более глянцевыми, эластичными и жевательными. Различные виды и разное количество этерифицированного крахмала играют разную роль в улучшении качества теста. Результаты показали, что добавление ацетата крахмала снижает водопоглощение теста на 4%, делая тесто более твердым.Тесто, содержащее 20% ацетата крахмала (DS: 0,03–0,04), снижает температуру пика желатинизации и изменяет эндотермическую энтальпию по сравнению с таким же количеством натурального крахмала тапиоки; таким образом, его можно использовать при приготовлении лапши для замедления старения [50]. Шукри и др. обнаружили реологическую разницу между тестом из чистой пшеничной муки и смешанным порошковым тестом, содержащим 15% фосфатно-сшитого сложного эфира крахмала, степень водопоглощения снизилась с 64,3% до 62,9%, время образования теста (DDT) было в 2 раза больше, чем у исходной муки , а индекс смешанной толерантности положительно коррелировал с добавленным количеством.Пшеничное тесто, богатое фосфорилированным крахмалом, имело значительно пониженную пластичность и имеет тенденцию ломаться быстрее, чем контрольное тесто. Что касается готовой продукции, то приготовленные на пару булочки, армированные сшитым фосфатом крахмала (15% и 30%), имели значительно меньшую твердость, липкость и жевательную способность, при этом эластичность не пострадала [51].

Качество теста во время замораживания можно также улучшить, добавив сложные эфиры крахмала. Во время замороженного хранения теста и повторяющихся циклов замораживания-оттаивания поверхностная влага будет потеряна из-за сублимации, а перекристаллизация воды и образование кристаллов льда вызовут физическое повреждение структуры глютена, что приведет к ослаблению гидрофобные связи [52, 53].Добавление ацетата крахмала и сшитого фосфата крахмала может эффективно замедлить старение замороженного теста и улучшить качество теста или хлеба, а сложный эфир крахмала с высокой степенью замещения более четко задерживает явление старения [54]. Октенилсукцинат крахмала также может значительно улучшить внутреннюю структуру замороженного теста и уменьшить старение крахмала. Когда кристаллы льда в тесте постепенно становились больше при охлаждении, молекулы амилопектина крахмала OSA могли образовывать гидрофильные и гидрофобные связи с другими компонентами теста (натуральный крахмал, белок, вода и липиды), тем самым укрепляя глютеновую сеть и избегая кристаллов льда. это нарушило структуру глютеновой сети, а также могло привести к разрушению и растрескиванию замороженного теста во время оттаивания.Точно так же октенилсукцинат крахмала действует как криопротектор белка, предотвращая денатурацию белка теста при низких температурах, что продлевает срок хранения теста.

Существует ряд важных технологических свойств крахмала, которые можно этерифицировать биотехнологическими, физическими и химическими методами. Этерифицированные крахмалы могут быть использованы для замены пшеничной муки в традиционной выпечке на уровне 20% без ухудшения качества конечной продукции. Их добавление влияет на водопоглощение и реологические параметры теста, пастообразные свойства крахмала, консистенцию и черствение полученной крошки.Это позволяет формулировать рецепты хлеба с особыми, строго контролируемыми свойствами [50]. Применение эстерифицированных крахмалов (ацетилированный адипат дистрахмала и фосфат гидроксипропилдистарха) вызывало увеличение объема полученных безглютеновых хлебов, и наблюдаемые различия были статистически значимыми на уровнях выше 10%. Изменения сопровождались изменением структурных свойств хлебной крошки, например уменьшением среднего размера ячеек и увеличением их количества.Однако при добавлении модифицированной крахмальной крошки структура крошки стала более эластичной, что выявилось по результатам релаксации напряжений. Незначительное снижение твердости и жевательной способности мякиша наблюдалось также в день выпечки, причем его степень зависела от уровня модифицированного крахмала и была несколько более выраженной в случае адипата крахмала [55].

4. Ожидание

Процесс получения и физико-химические свойства различных сложных эфиров крахмала были подробно изучены, но в настоящее время все еще существует много недостатков.Эффективность этерификации в химическом синтезе все еще оставалась неудовлетворительной, и, с другой стороны, ожидалось, что придется решить проблему дороговизны и использования органического растворителя, которые вредны для окружающей среды и здоровья человека. С развитием ферментативного синтеза в последние несколько лет будущий процесс станет более экологически безопасным и эффективным. В то же время, за исключением простого этерифицированного крахмала, комплексный модифицированный крахмал также получил большое внимание. С постоянным совершенствованием технологии этерифицированный крахмал будет иметь больше возможностей для разработки в области продуктов питания, биоматериалов и других областях.Технология производства будет постепенно созревать и адаптироваться к тенденциям современного промышленного производства.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить NSFC за финансовую помощь в соответствии с контрактами NSFC на исследования №№. 31701636 и 31171789 и Национальная программа ключевых исследований и разработок (№ 2016YFD0401302).

Границы | Механизм избыточного накопления крахмала у мутантов с высоким содержанием крахмала Chlamydomonas reinhardtii, идентифицированный с помощью сравнительного транскриптомного анализа

• ¹ Институт перспективных радиационных технологий, Корейский научно-исследовательский институт атомной энергии, Чонжап, Южная Корея
• ² Департамент биологических наук, Национальный университет Чонбук, Чонджу, Южная Корея
• ³ Центр молекулярных биологических исследований, Корейский научно-исследовательский институт биологии и биотехнологии, Тэджон, Южная Корея

В центре внимания данного исследования был механизм накопления крахмала у мутантов с высоким содержанием крахмала Chlamydomonas reinhardtii .Три C . reinhardtii Мутанты с высоким содержанием крахмала были получены с использованием гамма-облучения. При выращивании в условиях дефицита азота эти мутанты содержали более чем в два раза больше крахмала, чем контроль дикого типа. Механизм чрезмерного накопления крахмала у этих мутантов был изучен с помощью сравнительного анализа транскриптомов. Во всех мутантах была обнаружена индукция экспрессии фосфоглюкомутазы 1 ( PGM1 ); PGM1 катализирует взаимное превращение глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фосфата как в биосинтетическом, так и в гликолитическом пути крахмала.Интересно, что уровни транскриптов фосфоглюкозоизомеразы 1 ( PGI1 ), фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы 1 и 2 ( FBA1 и FBA2 ) были подавлены у всех мутантов; PGI1, FBA1 и FBA2 действуют после преобразования глюкозо-6-фосфата в гликолитическом пути. Следовательно, подавление PGI1, FBA1 и FBA2 может приводить к накоплению вышестоящих метаболитов, в частности, глюкозо-6-фосфата, что приводит к индукции экспрессии PGM1 посредством прямой регуляции и к тому, что гиперэкспрессия PGM1 вызывает чрезмерное накопление крахмала у мутантов.Эти результаты подтверждают, что PGI1, FBA1, FBA2 и PGM1 коррелируют друг с другом в терминах координированной регуляции транскрипции и играют центральные роли в избыточном накоплении крахмала в C . Reinhardtii .

Введение

Мировые потребности в энергии велики и растут и по многим причинам не могут быть удовлетворены с помощью одних только традиционных источников энергии. Биоэнергетика — многообещающий альтернативный источник энергии, особенно привлекательный, поскольку он является возобновляемым.Биотопливо в основном получают из продовольственных культур (Чисти, 2007; Шарма и др., 2012). Однако, поскольку для их производства необходимы обрабатываемые земли, производители биоэнергетических культур конкурируют с производителями продуктов питания за сельскохозяйственные земли. Микроводоросли обладают потенциалом в качестве источника биоэтанола и биодизеля (Chisti, 2007; de Faria Silva and Bertucco, 2016), и для их роста не требуются сельскохозяйственные земли (Li et al., 2008). Эти организмы производят большее количество биомассы, чем культурные растения, а зеленые водоросли также производят крахмал, который можно использовать для производства биоэтанола (Doana et al., 2012).

Крахмал — это полисахарид, запасная форма углеводов, которые присутствуют в пластидах, образуются в хлоропластах высших растений и некоторых водорослях во время фотосинтеза. Крахмал состоит из амилопектина и амилозы. Амилопектин, разветвленная цепь глюкозных единиц, является основным компонентом крахмала. Другой молекулой, содержащей крахмал, является амилоза, которая может быть спиральной или линейной (Buleon et al., 1998). Биосинтез крахмала широко изучался на многих растениях, включая одноклеточную зеленую водоросль Chlamydomonas reinhardtii (Buleon et al., 1998; Стреб и Зееман, 2012; Busi et al., 2015). Изучить молекулярные механизмы биосинтеза крахмала и липидов в ответ на лишение азота в C . reinhardtii , транскриптомный и протеомный анализ проводили с использованием некрахмалистого мутанта sta6 ; этот мутант продемонстрировал активацию путей как глиоксилата, так и глюконеогенеза в условиях азотного голодания, что привело к чрезмерному накоплению ТАГ (Blaby et al., 2013; G динаф и др., 2014; Schmollinger et al., 2014). Кроме того, анализ системной биологии для C . reinhardtii в ответ на азотное голодание сообщили Park et al. (2015), которые предоставили фундаментальное понимание биосинтеза крахмала и ТАГ. Schulz-Raffelt et al. (2016) сообщили о деградации крахмала 1 мутант ( std1 ) показал гипер-накопление как крахмала, так и ТАГ в фотоавтотрофных условиях при недостатке питательных веществ. С . reinhardtii производит крахмал путем фотосинтетической фиксации углерода в фототрофных условиях, а также использует соединения с пониженным содержанием углерода, такие как ацетат, в гетеротрофных и миксотрофных условиях (Johnson and Alric, 2013).Есть два пути ассимиляции ацетата для синтеза ацетилкофермента A (Acetyl-CoA) в C . reinhardtii ; ацетил-КоА-синтетаза (ACS) участвует только в одностадийном превращении, либо ацетаткиназа (ACK) и фосфат-ацетилтрансфераза (PAT) участвуют в двухстадийном превращении (Harris, 2009; Spalding, 2009; Johnson and Alric, 2013).

Общий для всех клеток путь гликолиза превращает глюкозу в пируват. Некоторые ферменты на верхних ступенях пути гликолиза также участвуют в биосинтезе крахмала (Denis and Greyson, 1987).Гликолитический путь состоит из трех стадий (Berg et al., 2002). На стадии 1 глюкоза превращается в 1,6-бисфосфат фруктозы в три этапа: фосфорилирование, изомеризация и другое фосфорилирование. На стадии 2 фруктозо-1,6-бисфосфат расщепляется на две трехуглеродные молекулы. Наконец, на стадии 3 трехуглеродные соединения окисляются до пирувата с образованием АТФ. У нерастений гликолиз происходит в цитоплазме; у растений он находится как в цитоплазме, так и в пластидах. У высших растений сахароза и крахмал необходимы в качестве субстратов для цитозольного и пластидного гликолиза соответственно (Plaxton, 1996).Некоторые из ферментов цитозольного гликолиза, по-видимому, не присутствуют во многих видах зеленых водорослей, что означает, что сахароза является относительно менее важным соединением для потока углерода в зеленых водорослях (Singh et al., 2008).

В настоящем исследовании молекулярный механизм чрезмерного накопления крахмала был исследован с использованием C . reinhardtii мутанты, показывающие высокое содержание крахмала посредством сравнительного анализа транскриптомов. Были идентифицированы ключевые гены, которые регулируют биосинтез крахмала и гликолиз / глюконеогенез для чрезмерного накопления крахмала.Это сравнительное исследование транскриптомов также предлагает фундаментальную информацию о биосинтезе крахмала и гликолизе / глюконеогенезе у зеленых водорослей.

Материалы и методы

Условия образования и культивирования мутантов

С высоким содержанием крахмала C . В этом исследовании были использованы мутанты reinhardtii (Sm142, Sm162 и Sm181), которые были получены из C . reinhardtii штамм cc124 (дикий тип) при гамма-облучении. Для создания мутантов с высоким содержанием крахмала C . reinhardtii клетки дикого типа (штамм cc124), выращенные в жидкой трис-ацетат-фосфатной (TAP) среде (Harris, 2009), обрабатывали гамма-излучением 100 Гр в течение 1 часа. Облученные клетки наносили на твердую среду TAP и инкубировали в течение 10 дней при 25 ° C при слабом освещении. Более 500 колоний, выращенных в среде TAP, переносили на твердую среду TAP с дефицитом азота (TAP-N; NH ₄ Cl был заменен на KCl) и инкубировали в течение 5 дней для индукции накопления крахмала. Для отбора кандидатов-мутантов с высоким содержанием крахмала проводили окрашивание колоний парами йода.Для выбранных кандидатов-мутантов содержание крахмала анализировали с использованием набора для анализа крахмала, как указано ниже. Для жидкой культуры, использованной в этом исследовании, приблизительно 1 × 10 ⁵ клеток инокулировали в 50 мл среды ТАР. Культуру встряхивали непрерывно

Определение хранения (крахмал / гликоген) и всего …

Аннотация

Это протокол для количественного определения запаса и общего количества углеводов в водорослях и цианобактериях.Протокол прост, быстр и чувствителен и требует всего нескольких стандартных химикатов. Большим преимуществом этого протокола является то, что и запасы, и общие сахариды могут быть определены в клеточных гранулах, которые уже использовались для количественного определения хлорофилла и каротиноидов. Поскольку рекомендуется выполнять измерение пигментов в трех экземплярах, каждый анализ пигмента может генерировать образцы как для общего содержания сахаридов, так и для количественного определения содержания гликогена / крахмала.

Протокол применялся для количественной оценки как накопленных, так и общих углеводов у цианобактерий Synechocystis sp.PCC 6803, Cyanothece sp. ATCC 51142 и Cyanobacterium sp. ИППАС Б-1200. Он также был применен для оценки полисахаридов хранения в Galdieria (IPPAS P-500, IPPAS P-507, IPPAS P-508, IPPAS P-513), Cyanidium caldarium IPPAS P-510, в зеленых водорослях Chlorella sp. IPPAS C-1 и C-1210, Parachlorella kessleri IPPAS C-9, Nannochloris sp. С-1509, Coelastrella sp. IPPAS H-626, Haematococcus sp.IPPAS H-629 и H-239, а в Eustigmatos sp. ИППАС Н-242 и ИППАС С-70.

Ключевые слова: сахара, углеводы, полисахариды, колориметрия, спектрофотометрия, Synechocystis , Chlorella , Haematococcus

Предпосылки

Углеводы играют ряд ролей в метаболизме водорослей и цианобактерий. Как хорошо резюмировали Рэйвен и Бирдалл (Raven and Beardall, 2003), углеводы представляют собой основной сток промежуточных продуктов в путях восстановления / окисления углерода (фотосинтез и фотодыхание), они обеспечивают скелеты, необходимые для роста ( e.грамм. , для аминокислот или биосинтеза клеточной стенки), они представляют собой источники АТФ и восстанавливающие эквиваленты (через дыхательные пути), они служат в качестве совместимых растворенных веществ, они необходимы для поддержания клеточного тургора (путем обеспечения жесткой структуры клеточной стенки) и они могут убирать свободные радикалы. Накопительные полисахариды (основными формами которых в водорослях и цианобактериях являются крахмал и гликоген) служат источником энергии и углерода, компенсируют диспропорцию между скоростью производства и потребления углеводов и обеспечивают активный метаболизм ( e.грамм. , азотфиксация) в темное время суток.

Углеводы регулярно анализируются во многих лабораториях биологических наук. Содержание сахаридов может быть определено количественно с помощью широкого диапазона химических (, например, , хроматографический), биохимических (, например, , гравиметрических, колориметрических, ферментативных) или физических (, например, , поляриметрических) методов. Оценка запаса углеводов, как описано в этом протоколе, представляет собой комбинацию очистки крахмала / гликогена в соответствии с предыдущими исследованиями (Schneegurt et al., 1994; Bandyopadhyay et al. , 2010 г .; Синетова и др. , 2012), разложение крахмала / гликогена в кислой среде и определение свободной глюкозы классическим фенол-сернокислотным методом (Dubois et al. , 1956; Masuko et al. , 2005). Оценка общих углеводов состоит из простого ресуспендирования клеточного осадка (после экстракции хлорофилла и каротиноидов) в растворе фенола и гидролиза клеточных сахаридов серной кислотой.

Преимущества этого протокола — простота, чувствительность и быстрота. Для оценки углеводов / гликогена / крахмала требуется только несколько стандартных реагентов, что делает этот протокол намного проще и дешевле по сравнению с протоколами, включающими ферментативное расщепление гликогена (De Porcellinis et al. , 2017; Khan et al. , 2018 ), ферментативное определение свободной глюкозы (Bandyopadhyay et al. , 2010; Sinetova et al. , 2012; Khan et al., 2018) или большое количество химикатов (Khan et al. , 2018). Еще одним преимуществом этого протокола является то, что для анализа требуется только 1 мл разбавленной суспензии культуры (дополнительные сведения см. В примечании 1), что значительно меньше, чем требуется в других протоколах (De Porcellinis et al. , 2017). Кроме того, измерение сахаридов / гликогена / крахмала может быть выполнено на тех же образцах, которые изначально использовались для определения содержания хлорофилла и каротиноидов (Sinetova et al., 2012 г.).

С другой стороны, этот протокол не так специфичен для определения запасных полисахаридов, как ферментные анализы (De Porcellinis et al. , 2017), поскольку гликоген или крахмал лишь частично отличаются от других клеточных полисахаридов (, например, , из полисахаридов клеточной стенки). Другим ограничением является использование D-глюкозы в качестве калибровочного стандарта, поскольку различные углеводы, присутствующие в клетках, различаются по спектрам поглощения (Dubois et al., 1956; Masuko et al. , 2005). Тем не менее, даже с этими ограничениями, этот дешевый, простой и быстрый протокол подходит для грубой оценки содержания углеводов в водорослях и цианобактериях.

Материалы и реагенты

1. Пробирки Safe-lock 1,5 мл SafeSeal (SARSTEDT, номер по каталогу: 72.706.400)
2. Rotilabo ^® Уплотнительные зажимы для трубок с безопасным замком (Carl Roth, каталожный номер: N217.1)
3. Держатели для трубок с замком (VWR, каталожный номер: 30128-282)
4. 96-луночные микропланшеты (тип P) с оригинальными крышками (Cole-Parmer, каталожные номера: EW-07903-80 и EW-07903-86)
   
5. Наконечники для пипеток
   
   1. Стандартные наконечники: 20-200 мкл, 100-1000 мкл (Mettler-Toledo International, каталожные номера: 17001118 и 17001129)
      
   2. Наконечники с фильтрами: 20-200 мкл (Mettler-Toledo International, каталожный номер: 17014963)
6. Емкость для многоканальной пипетки 60 мл (BrandTech Scientific, каталожный номер: 703459)
7. Алюминиевая фольга (по желанию)
8. Культура цианобактерий / водорослей
9. Метанол ≥ 99.9% (Alfa Aesar, каталожный номер: 41467.K7)
10. Фенол (Sigma-Aldrich, каталожный номер: P1037)
11. Гидроксид калия p.a. (Ing. Petr Švec — PENTA, каталожный номер: 15520-31000)
12. Этанол 96% (Merck, каталожный номер: 15
    500)
13. Серная кислота 96% (Ing. Petr Švec — PENTA, каталожный номер: 20370-11000)
14. D-глюкоза (Sigma-Aldrich, каталожный номер: G8270)
15. Дистиллированная / дважды деионизированная вода
16. Гидроксид натрия (Ing.Петр Швец — PENTA, каталожный номер: 15760-31000)
17. Соляная кислота (Ing. Petr Švec — PENTA, каталожный номер: 19360-11000)
18. Серия калибровки глюкозы (см. Рецепты)
    

Оборудование

1. Пипетки
   
   1. 20-200 мкл (Mettler-Toledo International, номер по каталогу: 17014391)
      
   2. 100-1000 мкл (Mettler-Toledo International, номер по каталогу: 17014382)
      
   3. Многоканальная пипетка 20-200 мкл (Mettler-Toledo International, номер по каталогу: 17013805)
2. Холодильник 4 ° C, морозильная камера -20 ° C (LIEBHERR, модель: LCexv 4010, номер по каталогу: