Методы определения протеина в кормах: ГОСТ 13496.4-93 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина

ГОСТ 13496.4-93 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина

ГОСТ 13496.4-93

Группа С19

МКС 65.120
ОКСТУ 9209

Дата введения 1995-01-01

1 РАЗРАБОТАН Госстандартом России

ВНЕСЕН Техническим секретариатом Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 г.

За принятие проголосовали:

Наименование государства	Наименование национального органа по стандартизации
Киргизская Республика	Киргизстандарт
Республика Молдова	Молдовастандарт
Российская Федерация	Госстандарт России
Республика Таджикистан	Таджикгосстандарт
Туркменистан	Главная государственная инспекция Туркменистана
Украина	Госстандарт Украины

3 Постановлением Комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 02.

06.94 N 160 межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.4-93 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 01.01.95

4 ВЗАМЕН ГОСТ 13496.4-84

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Март 2011 г.

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Настоящий стандарт распространяется на все виды кормов, комбикорма и комбикормовое сырье (за исключением минерального происхождения, дрожжей кормовых и паприна) и устанавливает титриметрический (по Кьельдалю) и фотометрический методы определения азота с последующим пересчетом результатов на сырой протеин.

1 Отбор проб

Отбор проб — по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 27262.

2 Титриметрический метод определения азота по Кьельдалю (основной метод)

Сущность метода заключается в разложении органического вещества пробы кипящей концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония, переведении аммония в аммиак, отгонке его в раствор кислоты, количественном учете аммиака титриметрическим методом и расчете содержания азота в исследуемом материале.

2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности по ГОСТ 24104* с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
________________
* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008 (здесь и далее).


Весы лабораторные 4-го класса точности по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 500 г или другие весы того же класса точности.

Измельчитель проб растений ИПР-2.

Соломорезка марки ИСР-1 или других марок.

Сушилка проб кормов марки СК-1 или шкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры не более 5 °С.

Мельница лабораторная марки МРП-2 или других марок.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Электронагреватели или горелки газовые.

Установка типа Кьельдаля или аппарат для отгонки аммиака с водяным паром (см. рисунки 1 и 2).

Рисунок 1 — Установка типа Кьельдаля

1 — колба вместимостью 1000 см; 2 — капельная воронка вместимостью 100 см; 3 — каплеуловитель; 4 — холодильник; 5 — приемная колба вместимостью 250 см; 6 — подъемный столик; 7 — колбонагреватель или электроплитка с регулятором температуры, или газовая горелка

Рисунок 1

Рисунок 2 — Аппарат для отгонки аммиака с водяным паром

1 — приемная колба; 2 — холодильник; 3 — каплеуловитель; 4 — отгонная колба; 5, 9 — воронки; 6, 7, 8 — краны; 10 — парообразователь

Рисунок 2

Капельница для индикатора.

Установка для титрования с бюреткой 2-го класса точности вместимостью 10, 25 или 50 см по ГОСТ 29252.

Ступки фарфоровые и пестик по ГОСТ 9147.

Колбы Кьельдаля вместимостью 100, 250 или 500 см.

Пробирки из термостойкого стекла вместимостью 50-100 см или колбы из термостойкого стекла вместимостью 100 см.

Воронки стеклянные диаметром 2-3 см по ГОСТ 25336 или втулки Кьельдаля.

Колба коническая вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.

Колбы мерные вместимостью 500 и 1000 см по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные вместимостью 50 и 1000 см по ГОСТ 1770.

Пипетки с делениями вместимостью 1 и 25 см по ГОСТ 29169.

Стакан фарфоровый вместимостью 1000 см по ГОСТ 9147.

Стакан химический вместимостью 50 см по ГОСТ 25336.

Асбест листовой.

Вещества, предотвращающие выбрасывание жидкости: кусочки фарфора, стеклянные бусинки, свежепрокаленные кусочки пемзы.

Кислота серная концентрированная по ГОСТ 4204, х. ч., ч. д. а. и стандарт-титр серной кислоты 0,05 моль/дм (0,1 н.) раствор.

Калий сернокислый по ГОСТ 4145, х. ч., ч. д. а.

Калий надсернокислый по ГОСТ 4146, ч. д. а.

Медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч. д. а., х. ч.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166, ч. д. а.

Селен, ч.

Перекись водорода по ГОСТ 10929, водный раствор с массовой долей 30%.

Кислота борная по ГОСТ 9656, ч. д. а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч. или ч. д. а., водный раствор с массовой долей 33-40%; 0,1 моль/дм раствор гидроокиси натрия, приготовленный по ГОСТ 25794.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*.
________________
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.


Метиловый красный.

Метиловый голубой или бромкрезоловый зеленый.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание. Допускается использовать аппаратуру, мерную посуду и другие средства измерений, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.

2.2 Подготовка к испытанию

2.2.1 Подготовка проб к испытанию

Среднюю пробу сена, силоса, сенажа, соломы, зеленых кормов и т.п. измельчают на отрезки длиной 1-3 см; корнеплоды и клубнеплоды разрезают на пластинки (ломтики) толщиной до 0,8 см. Методом квартования выделяют часть средней пробы, масса которой после высушивания должна быть не менее 50 г. Высушивание проб проводят в сушильном шкафу при температуре 60-65 °С до воздушно-сухого состояния.

После высушивания воздушно-сухую пробу размалывают на лабораторной мельнице и просеивают через сито. Трудноизмельчимый остаток на сите после ручного измельчения ножницами или в ступке добавляют к просеянной части и тщательно перемешивают.

Среднюю пробу комбикормов и комбикормового сырья размалывают и просеивают без предварительного подсушивания.

Приготовленные для испытания пробы хранят в стеклянной или пластмассовой банке с притертой пробкой (крышкой) в сухом месте.

Пробы жидких кормов анализируют без предварительной подготовки.

2.2.2 Подготовка реактивов и растворов

2.2.2.1 Приготовление смешанных катализаторов

Катализатор 1. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди, 100 весовых частей сернокислого калия и 2 весовые части селена, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

Катализатор 2. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди и 100 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять сернокислый калий надсернокислым калием или сернокислым натрием в том же количестве.

2.2.2.2 Приготовление раствора серной кислоты, содержащей селен

Аморфный или растертый селен, из расчета 5 г на 1 дм кислоты, растворяют при нагревании в концентрированной серной кислоте в термостойкой колбе до обесцвечивания.

2.2.2.3 Приготовление раствора серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм (0,1 н)

Используют стандарт-титр серной кислоты. Растворы готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.

Допускается приготовление раствора серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм из концентрированной серной кислоты в соответствии с требованиями ГОСТ 25794.1.

2.2.2.4* Приготовление раствора борной кислоты с массовой концентрацией 4%

40 г борной кислоты растворяют в небольшом количестве теплой воды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 см. После охлаждения доводят объем водой до 1000 см.
________________
* Письмом Росстандарта от 12.01.2018 г. N АШ-215/03 разъясняется следующее: в пункте 2.2.2.4 ГОСТ 13496.4-93 допущена опечатка. — Примечание изготовителя базы данных.

2.2.2.5 Приготовление смешанного индикатора

При титровании применяют один из следующих индикаторов:

индикатор 1 — растворяют 0,20 г метилового красного и 0,10 г метиленового голубого в 100 см 96%-ного раствора этилового спирта;

индикатор 2 — смешивают 3 объема 0,1%-ного раствора бромкрезолового зеленого в этиловом спирте и 1 объем 0,2%-ного раствора метилового красного в этиловом спирте. Хранят индикаторы в темной склянке.

2.2.2.6 Приготовление раствора гидроокиси натрия с массовой долей 33%

330 г гидроокиси натрия растворяют в фарфоровом стакане в 670 см дистиллированной воды.

2.2.2.7 Приготовление раствора гидроокиси натрия с массовой долей 40%

400 г гидроокиси натрия растворяют в фарфоровом стакане в 600 см дистиллированной воды.

2.3 Проведение испытания

2.3.1 Приготовление минерализата

В длинной сухой пробирке, свободно входящей в горло колбы Кьельдаля, взвешивают 0,7-1 г кормов растительного происхождения, комбикормов, 0,3-0,5 г муки животного происхождения или 0,4-0,5 г дрожжей с погрешностью не более 0,001 г. Вставив пробирку в колбу Кьельдаля до ее дна, высыпают навеску и вновь взвешивают пробирку. По разности между первым и вторым взвешиваниями определяют массу навески, взятую для анализа. Минерализацию осуществляют одним из двух способов:

способ 1. Добавляют в колбу Кьельдаля 2 г смешанного катализатора 1 или 8 г катализатора 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10-12 см концентрированной серной кислоты в зависимости от массы навески;

способ 2. Добавляют в колбу Кьельдаля 10 см водного раствора перекиси водорода с массовой долей 30% в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции приливают такое же количество концентрированной серной кислоты. Для ускорения сжигания рекомендуется использовать серную кислоту, содержащую селен, приготовленную по п.2.2.2.2.

Содержимое колбы Кьельдаля тщательно перемешивают легкими круговыми движениями, обеспечивая полное смачивание навески. Колбу устанавливают на нагреватель так, чтобы ее ось была наклонена под углом 30-45° к вертикали, в горло колбы вставляют маленькую стеклянную воронку или втулку для уменьшения улетучивания кислоты во время минерализации. Вначале колбу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразование.

При нагревании навеску время от времени помешивают вращательными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усиливают, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. Нагрев считается нормальным, если пары кислоты конденсируются ближе к середине горла колбы Кьельдаля, избегая перегрева стенок колбы, не соприкасающихся с жидкостью. Если используют открытое пламя, то такой перегрев можно предотвратить, помещая колбу на лист асбеста с отверстием по диаметру несколько меньшим, чем диаметр колбы на уровне жидкости.

После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают в течение 30 мин. После охлаждения минерализат количественно переносят в отгонную колбу, три раза ополаскивают колбу Кьельдаля 20-30 см дистиллированной воды. Общий объем раствора в отгонной колбе должен составлять 200-250 см.

Допускается проводить отгонку непосредственно из колбы Кьельдаля. В этом случае для минерализации используют колбу Кьельдаля вместимостью 500 см. Перед отгонкой аммиака минерализат разбавляют 150-200 см дистиллированной воды.

При проведении экспресс-анализа на комбикормовых предприятиях и в период заготовки травянистых кормов допускается следующий способ приготовления минерализата.

Навеску испытуемой пробы массой 0,2-0,3 г помещают в колбу Кьельдаля или в пробирку, или в колбу из термостойкого стекла. В колбу с навеской добавляют 4 см, а в пробирку — 3 см водного раствора перекиси водорода с массовой концентрацией 30%. Через 1,5-2 мин в колбу добавляют 5-8 см, а в пробирку — 2 см концентрированной серной кислоты, содержащей селен, приготовленной по 2.2.2.2. Содержимое колбы или пробирки тщательно перемешивают для полного смачивания навески. Колбу или пробирку с навеской помещают на электронагреватель и нагревают до кипения. Затем нагрев увеличивают и минерализацию продолжают до полного обесцвечивания раствора (20-30 мин). Если раствор не осветлился, то нагревание продолжают еще 5-8 мин или охлаждают, приливают 0,5 см раствора перекиси водорода с массовой концентрацией 30% и кипятят до полного обесцвечивания. После охлаждения минерализат количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. В отгонную колбу переносят 50 см раствора минерализата.

2.3.2 Отгонка аммиака и титрование

2.3.2.1 Отгонка аммиака в борную кислоту

В приемную колбу наливают 20 см раствора борной кислоты с массовой концентрацией 4% и 5 капель любого из смешанных индикаторов. Колбу подставляют под холодильник так, чтобы его кончик был погружен в раствор борной кислоты на глубину не менее чем 1 см. Через холодильник пропускают холодную воду.

Отгонную колбу присоединяют к аппарату для отгонки аммиака и через капельную воронку осторожно приливают в колбу с минерализатом раствор гидроокиси натрия с массовой долей 33%. Воронку промывают 2-3 раза 10-15 см дистиллированной воды, оставляя небольшое количество воды в качестве гидрозатвора. Допускается прибавлять раствор гидроокиси натрия до присоединения отгонной колбы к аппарату. В этом случае раствор гидроокиси натрия наливают в отгонную колбу по стенке, стараясь не перемешивать его с минерализатом, и сразу присоединяют к аппарату для отгонки аммиака.

Объем приливаемой гидроокиси натрия зависит от объема серной кислоты, использованной для приготовления минерализата. На каждый кубический сантиметр серной кислоты, оставшейся после окончания процесса минерализации, следует добавлять не менее 3,5 см раствора гидроокиси натрия массовой долей 33%. Если объем оставшейся серной кислоты трудно установить, объем щелочи рассчитывают исходя из объема серной кислоты, взятой для минерализации. Допускается предварительная нейтрализация содержимого отгонной колбы раствором гидроокиси натрия массовой долей 40%, используя любой из индикаторов. Для обеспечения выделения аммиака добавляют дополнительно 1 см раствора гидроокиси натрия массовой долей 40%.

Отгонную колбу нагревают с помощью электронагревателя или газовой горелки. Раствор в отгонной колбе нагревают так, чтобы обеспечить равномерное кипение. Допускается проводить отгонку водяным паром. Чтобы исключить выделение аммиака, вода в парообразователе должна быть подкислена серной кислотой до фиолетовой окраски при применении индикатора 1 и розовой — при применении индикатора 2.

В начале отгонки аммиака цвет раствора в приемной колбе меняется на зеленый. При нормальном кипении объем раствора в приемной колбе через 20-30 мин обычно составляет 150-200 см. При проведении экспресс-анализа время отгонки сокращается до 7-10 мин. Конец отгонки можно установить с помощью красной лакмусовой бумажки. Для этого приемную колбу отставляют от аппарата, предварительно обмыв конец холодильника дистиллированной водой, и подставляют лакмусовую бумажку под стекающие капли дистиллята. Если лакмус не синеет, отгон аммиака закончен. Если лакмус синеет, приемную колбу снова подставляют под холодильник и продолжают отгонку. После окончания отгонки приемную колбу опускают и конец холодильника обмывают дистиллированной водой в приемную колбу. Оттитровывают аммиак из бюретки раствором серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм до перехода окраски индикатора от зеленой в фиолетовую при применении индикатора 1 и от зеленой в розовую при применении индикатора 2.

2.3.2.2 Отгонка аммиака в серную кислоту

В приемную колбу пипеткой наливают 50 см раствора серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм. Отгонку ведут способом, указанным в п.2.3.2.1. После окончания отгонки содержимое приемной колбы (избыток раствора серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм) титруют раствором гидроокиси натрия ()=0,1 моль/дм до перехода окраски в зеленую.

2.3.2.3 Одновременно с проведением испытания проводят контрольный опыт на загрязнение воды и реактивов аммиаком, исключая взятие навески корма.

Объем серной кислоты, израсходованный на титрование в контрольном опыте при отгонке в борную кислоту, не должен превышать 0,5 см. При отгонке в серную кислоту объем раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование, должен быть не менее 49,5 см. В случае превышения установленных норм выявляют источники загрязнения реактивов аммиаком и устраняют их.

2.4 Обработка результатов

2. 4.1 Массовую долю азота () в испытуемой пробе в процентах при проведении отгонки аммиака в борную кислоту вычисляют по формуле

,

где — объем раствора серной кислоты, израсходованный на титрование испытуемого раствора, см;

— объем раствора серной кислоты, израсходованный на титрование в контрольном опыте, см;

— поправка к титру раствора серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм, если он приготовлен не из стандарт-титра;

0,0014 — масса азота, эквивалентная массе серной кислоты, содержащейся в 1 см раствора (1/2)=0,05 моль/дм;

— масса навески, г;

100 — коэффициент пересчета в проценты.

2.4.2 Массовую долю азота () в испытуемой пробе в процентах при проведении отгонки аммиака в серную кислоту вычисляют по формуле

,

где — объем раствора гидроокиси натрия ()=0,1 моль/дм, израсходованный на титрование раствора серной кислоты (1/2)=0,05 моль/дм в контрольном опыте, см;

— объем раствора гидроокиси натрия ()=0,1 моль/дм, израсходованный на титрование серной кислоты в испытуемом растворе, см;

— поправка к титру раствора гидроокиси натрия ()=0,1 моль/дм;

0,0014 — масса азота, эквивалентная массе серной кислоты, содержащейся в 1 см раствора (1/2)=0,05 моль/дм;

— масса навески, г;

100 — коэффициент пересчета в проценты.

Примечание. При проведении экспресс-анализа полученный результат увеличивают в два раза, так как для отгонки используется лишь половина объема минерализата.


За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

2.4.3 Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений () и между двумя результатами, полученными в разных условиях () (в разных лабораториях, в разное время, при работе на разных приборах и т.д.), при доверительной вероятности =0,95 не должны превышать следующих значений:

,

,

где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %;

— среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в разных условиях, %.

Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений и испытаний, проведенных в разных условиях, могут иметь иное выражение, оговоренное в нормативно-технической документации на данный вид продукта.

Предельную погрешность результата анализа () при односторонней доверительной вероятности =0,95 вычисляют по формуле

.

Предельную погрешность результата анализа используют при оценке качества кормов.

Допускается проведение анализа без параллельных определений при наличии в партии исследуемых проб стандартных образцов (СО). В этом случае (при обязательном проведении выборочного статистического контроля сходимости параллельных определений) за результат испытания принимают результат единичного определения, если разница между воспроизведенной и аттестованной в СО массовой долей азота () не превышает

,

где — аттестованное значение определяемого компонента, взятое из свидетельства на СО, %.

Контрольные анализы образцов исследуемой партии и анализы СО проводят в соответствии с утвержденной научно-технической документацией.

2.4.4 Массовую долю азота в сухом веществе () в процентах вычисляют по формуле

,

где — массовая доля азота в испытуемой пробе, %;

— массовая доля влаги в испытуемой пробе, %.

2.5 Массовую долю сырого протеина в испытуемой пробе () или в сухом веществе () в процентах вычисляют по формуле

,

где 6,25 — коэффициент пересчета общего содержания азота на сырой протеин;

— массовая доля азота в испытуемой пробе, %;

— массовая доля азота в сухом веществе, %.

3 Фотометрический индофенольный метод определения азота

Сущность метода заключается в разложении органического вещества пробы концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония и последующем фотометрическом определении азота в виде окрашенного индофенольного соединения, образующегося в щелочной среде при взаимодействии с салицилатом и гипохлоритом натрия и имеющего максимум светопоглощения при 655 нм. Концентрация азота в фотометрируемых растворах должна быть 0,01-0,14 мг/см.

3.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные 2-го класса точности по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г или аналогичные по точности и весы лабораторные 4-го класса точности по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 500 г или другие весы того же класса точности.

Измельчитель проб растений ИПР-2.

Соломорезка марки ИСР-1 или других марок.

Сушилка проб кормов марки СК-1 или шкаф сушильный лабораторный с погрешностью поддержания температуры не более 5 °С.

Мельница лабораторная марки МРП-2 или других марок.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Фотоэлектроколориметр, имеющий светофильтр с максимумом светопропускания в области 620-670 нм.

Электронагреватель с температурой нагрева 350-400 °С или горелки газовые.

Груша резиновая.

Пробирки из термостойкого стекла вместимостью 50-100 см или колбы из термостойкого стекла вместимостью 100 см.

Дозатор вместимостью 3 см или градуированная пипетка вместимостью 3 см по ГОСТ 29169.

Пипетка поршневая или пипетка вместимостью 2 см по ГОСТ 29169.

Шприц-дозатор или градуированные пипетки вместимостью 0,5 и 2,5 см по ГОСТ 29169.

Дозатор вместимостью 50 см или цилиндр мерный вместимостью 50 см по ГОСТ 1770.

Колбы Кьельдаля вместимостью 100 и 500 см.

Колбы мерные вместимостью от 100 до 1000 см по ГОСТ 1770.

Стаканы химические или колбы конические вместимостью 100 см по ГОСТ 25336.

Бюретки и градуированные пипетки вместимостью до 50 см по ГОСТ 1770.

Аммоний хлористый по ГОСТ 3773, ч. д. а.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч. д. а., раствор ()=2 моль/дм.

Натрий салициловокислый, ч. д. а.

Натрий нитропруссидный, ч. д. а.

Калий-натрий виннокислый по ГОСТ 5845, ч. д. а.

Соль динатриевая этилендиамин-N’, N’, N’, N’-тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х. ч.

Кислота серная по ГОСТ 4204, ч. д. а.

Известь хлорная техническая.

Селен, ч.

Перекись водорода по ГОСТ 10929, раствор массовой концентрации 30%, х. ч.

Натрий углекислый безводный по ГОСТ 83, ч. д. а.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, ч. д. а.

Калий йодистый по ГОСТ 4232, ч. д. а.

Натрий серноватистокислый (тиосульфат), стандарт-титр.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

3.2 Подготовка к испытанию — по 2.2.1.

3.2.1 Приготовление растворов

3.2.1.1 Приготовление раствора 1

57 г салициловокислого натрия, 17 г калия-натрия виннокислого и 27 г гидроокиси натрия растворяют в 700 см дистиллированной воды. Раствор кипятят около 20 мин для удаления следов аммиака. После охлаждения к полученному раствору добавляют 0,4 г нитропруссида натрия и доводят объем до 1 дм дистиллированной водой. В хорошо закрытой склянке реактив может храниться в холодильнике до 1 мес.

3.2.1.2 Приготовление раствора 2

К 50 см раствора 1 приливают 400 см дистиллированной воды и 10 см раствора гидроокиси натрия ()=2 моль/дм, затем добавляют 1 г трилона Б. Раствор готовят в день проведения анализа.

3. 2.1.3 Приготовление раствора 3

150 г хлорной извести перемешивают в стакане вместимостью 500 см с 250 см дистиллированной воды. В другом стакане 105 г углекислого натрия растворяют в 250 см дистиллированной воды. Оба раствора сливают при постоянном перемешивании. Масса сначала густеет, затем разжижается. Суспензию оставляют на 1-2 сут для отстаивания, затем прозрачную жидкость сливают и декантируют через бумажный фильтр.

В растворе 3 определяют концентрацию активного хлора. Для этого 1 см прозрачного фильтрата раствора 3 разбавляют в конической колбе вместимостью 100 см дистиллированной водой до 40-50 см, прибавляют 2 г йодистого калия и 10 см 1 моль/дм раствора соляной кислоты. Образовавшийся йод оттитровывают раствором тиосульфата натрия ()=0,1 моль/дм, приготовленного из стандарт-титра, до исчезновения вишневой окраски.

Концентрацию активного хлора (), г/дм, вычисляют по формуле

,

где — объем раствора тиосульфата натрия ()=0,1 моль/дм, израсходованный на титрование 1 см раствора 3, см;

0,00355 — масса хлора, соответствующая 1 см раствора тиосульфата натрия ()=0,1 моль/дм, г;

1000 — коэффициент пересчета.

Раствор 3 хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до 1 года.

3.2.1.4 Приготовление раствора 4

Раствор 3 разбавляют дистиллированной водой до концентрации активного хлора 1,2 г/дм и используют для анализа в течение дня.

Объем раствора 3, необходимый для приготовления определенного объема раствора 4, вычисляют по формуле

,

где 1,2 -требуемая концентрация хлора, г/дм;

— объем раствора 3, необходимый для приготовления см раствора 4, см;

— приготовляемый объем раствора 4, см;

— концентрация активного хлора, г/дм.

3.2.1.5 Приготовление раствора серной кислоты, содержащей селен, — по 2.2.2.2.

3.2.1.6 Приготовление основного раствора хлористого аммония

Навеску 1,919 г хлористого аммония (содержащего 99,5% основного вещества) растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора дистиллированной водой до 1000 см. Раствор содержит 0,5 мг азота в 1 см.

3.2.1.7 Приготовление растворов сравнения и построение градуировочного графика

Берут восемь пронумерованных мерных колб вместимостью 100 см и приливают из бюретки вместимостью 50 см указанные в таблице 1 объемы основного раствора. Затем в каждую колбу доливают до половины ее объема дистиллированную воду и приливают 3 см концентрированной серной кислоты, содержащей селен, приготовленной по 2.2.2.2, и перемешивают. После охлаждения доводят объемы растворов дистиллированной водой до метки и снова перемешивают.


Таблица 1

Номер колбы	Объем основного раствора, см	Содержание азота в 100 см раствора сравнения, мг
1	0	0
2	4	2,0
3	8	4,0
4	12	6,0
5	16	8,0
6	20	10,0
7	24	12,0
8	28	14,0

Перед началом каждого испытания для построения градуировочного графика из каждой колбы растворов сравнения берут по 0,5 см раствора и помещают в пронумерованные восемь стаканов вместимостью 100 см, затем в каждый стакан добавляют по 50 см раствора 2, перемешивают и добавляют по 2,5 см раствора 4, снова перемешивают и оставляют растворы на 1 ч при комнатной температуре для полного развития окраски.

Оптическую плотность растворов измеряют относительно первого раствора сравнения, не содержащего азот, в кюветах с толщиной просвечиваемого слоя 10 мм, используя красный светофильтр с максимумом пропускания 620-670 нм.

По результатам фотометрирования растворов сравнения строят градуировочный график, откладывая на оси абсцисс значения содержания азота в миллиграммах в 100 см растворов сравнения, а на оси ординат — показатели оптической плотности растворов.

3.3 Проведение испытания

3.3.1 Приготовление минерализата

В длинной сухой пробирке, свободно входящей в горло термостойкой колбы или в пробирку для сжигания, взвешивают 0,2-0,3 г исследуемой пробы корма. Вставив пробирку с навеской в колбу или в пробирку для сжигания до ее дна, высыпают навеску и вновь взвешивают пробирку. По разности между первым и вторым взвешиванием определяют массу навески, взятой для анализа. К навеске добавляют 2 см 30%-ного раствора перекиси водорода. Через 1,5-2 мин добавляют 3 см концентрированной серной кислоты, содержащей селен, и слегка встряхивают. Пробирки или колбы постепенно нагревают до 340-380 °С. Минерализацию проб продолжают до полного обесцвечивания раствора. Если через 1,5-2 ч не происходит обесцвечивания, раствор охлаждают до 60-80 °С, приливают 1 см перекиси водорода и кипятят до полного обесцвечивания.

После обесцвечивания раствор охлаждают, количественно переносят в мерную колбу, доводят дистиллированной водой до 100 см и перемешивают. Допускается проводить минерализацию в калиброванных пробирках.

3.3.2 Фотометрическое определение азота в минерализатах

Для определения азота в коническую колбу или стакан вместимостью 100 см пипеткой или шприцем-дозатором отбирают 0,5 см минерализата, приготовленного по 3.3.1, приливают к нему 50 см раствора 2 и перемешивают, затем прибавляют пипеткой или шприцем-дозатором 2,5 см раствора 4, снова перемешивают и оставляют раствор на 1 ч при комнатной температуре для полного развития окраски.

Оптическую плотность растворов измеряют относительно раствора сравнения, не содержащего азот, в кюветах с толщиной просвечиваемого слоя 10 мм, используя красный светофильтр с максимумом пропускания 620-670 нм.

Если показание прибора для испытуемого раствора превышает показание восьмого раствора сравнения, то исходный раствор минерализата, приготовленный по 3.3.1, разбавляют первым раствором сравнения до оптимальной для фотометрирования концентрации (оптическая плотность 0,2-0,8).

Одновременно проводят контрольный опыт на загрязнение воды и реактивов аммиаком, исключая взятие навески корма.

3.4 Обработка результатов

3.4.1 Массовую долю азота () в процентах в исследуемой пробе вычисляют по формуле

,

где — содержание азота в навеске (в 100 см раствора), найденное по градуировочному графику, мг;

— содержание азота в 100 см раствора контрольного опыта, найденное по градуировочному графику, мг;

— масса навески, мг.

Если исходный раствор минерализата перед анализом был разбавлен, полученный результат увеличивают во столько раз, во сколько был разбавлен исходный раствор.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

3.4.2 Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений () и между двумя результатами, полученными в разных условиях () (в разных лабораториях, в разное время, при работе на разных приборах и т.д.), при доверительной вероятности =0,95 не должны превышать следующих значений:

;

,

где — среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %;

— среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в разных условиях, %.

Предельную погрешность результата анализа () при односторонней доверительной вероятности =0,95 вычисляют по формуле

.

Допускается проведение анализа без параллельных определений при наличии в партии исследуемых проб стандартных образцов (СО). В этом случае (при обязательном проведении выборочного статистического контроля сходимости параллельных) за результат испытания принимают результат единичного определения, если разница между воспроизведенной и аттестованной в СО массовой долей азота () не превышает

,

где — аттестованное значение определяемого компонента, взятое из свидетельства на СО.

3.4.3 Массовую долю азота в сухом веществе вычисляют по 2.4.4.

3.5 Массовую долю сырого протеина в испытуемой пробе или в сухом веществе вычисляют по 2.5.

ПРИЛОЖЕНИЕ (обязательное). Определение содержания азота и вычисление содержания сырого протеина (ИСО 5983-79)

ПРИЛОЖЕНИЕ
(обязательное)

________________
* В Российской Федерации см. ГОСТ Р 51417-99.


Стандарт используется при импортных и экспортных операциях для контроля качества кормов по содержанию в них азота и сырого протеина.

Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения содержания азота в кормах для животных по Кьельдалю и метод вычисления содержания сырого протеина.

Метод не делает различий между белковым и небелковым азотом. Если требуется определить содержание небелкового азота, должны быть использованы соответствующие методы. В некоторых случаях этот метод не позволяет полностью обнаружить азот нитратов и нитритов.

Продукты пищевые сельскохозяйственные. Общее руководство по определению азота методом Кьельдаля.

Разложение органического вещества серной кислотой в присутствии катализатора, высвобождение продукта реакции щелочью, дистилляция и титрование высвобождающегося аммиака. Вычисление содержания азота и умножение результата на коэффициент 6,25, чтобы получить содержание сырого протеина.

Все реактивы должны быть квалификации чистые для анализов. Используемая вода должна быть дистиллированная или вода такой же чистоты.

Все реактивы, за исключением стандартных образцов (5.6), должны быть практически свободны от азотистых соединений.

5.1 Сульфат калия.

5.2 Катализатор.

Предупреждение. Обращается внимание на токсичность соединений ртути. Необходимо соблюдать все меры предосторожности. Растворы, содержащие ртуть, нельзя непосредственно выливать в дренажную систему, а следует собрать для последующей обработки.

5.2.1 Ртуть или

5.2.2 Окись ртути (II) (), или

5.2.3 Окись меди (II) (), или

5.2.4 Сернокислая медь (II) пятиводная ().

5.3 Серная кислота 1,84 г/см.

5.4 Парафиновая смола.

5. 5 Сахароза.

5.6 Стандартные образцы.

5.6.1 Ацетанилид, точка плавления 114 °С, содержание азота () 10,37% ().

5.6.2 Триптофан, точка плавления 282 °С, содержание азота () 13,37 ().

5.7 Раствор гидроокиси натрия, 33% ().

5.8 Реактив для осаждения ртути.

5.8.1 Раствор тиосульфата натрия, приготовленный растворением 80 г тиосульфата пятиводного () в 1000 см воды или

5.8.2 Гипофосфит натрия или калия.

5.9 Поглощающая жидкость.

5.9.1 Серная кислота (1/2)=0,05 и 0,125 моль/дм, стандартный титрованный раствор или

5.9.2 Раствор борной кислоты, 40 г/дм.

5.10 Раствор для титрования.

5.10.1 Гидроокись натрия, ()=0,1 и 0,25 моль/дм, стандартный титрованный раствор или

5. 10.2 Серная кислота, (1/2)=0,05 и 0,125 моль/дм, стандартный титрованный раствор.

5.11 Смешанный индикатор.

Растворяют 2 г метилового красного и 1 г метиленового голубого в 1000 см 95%-ного (объемный) этанола.

5.12 Лакмусовая бумага.

5.13 Вещества, предотвращающие выбрасывание жидкости: гранулы пемзы или стеклянные бусинки, диаметром 5-7 мм, или кусочки карборунда, промытые соляной кислотой и кальцинированные.

Обычная лабораторная аппаратура, а также:

6.1 Аналитические весы.

6.2 Установки для сжигания, дистилляции и титрования.

Образцы хранят в условиях, не допускающих порчу и изменение состава.

8.1 Взятие навески

Взвесить навеску пробы с точностью 1 мг, содержащую 0,005-0,08 г азота. Масса навески должна быть между 0,5 и 2,0 г (предпочтительно 1,0 г).

Примечание. Когда в связи с неоднородностью пробы значение навески больше, чем указано выше, и поэтому ожидаемое содержание азота будет превышать 0,08 г, соответственно увеличивают объем серной кислоты в приемной колбе (см. 8.2.2), если в качестве приемной жидкости используют серную кислоту.

8.2 Определение

Предупреждение! Последующие операции должны проводиться под хорошо вентилируемым колпаком или в вытяжном шкафу.

8.2.1 Разложение органического вещества

Испытуемую навеску количественно переносят в колбу Кьельдаля соответствующей вместимости (обычно 800 см). Добавляют сульфат калия (5.1). Если в качестве катализатора используют ртуть или окись ртути (II), достаточно 10 г сульфата. Когда катализатором служит окись меди (II) или пятиводный сульфат меди (II), требуется 15 г сульфата калия.

Добавляют соответствующее количество катализатора: для всех продуктов могут быть использованы 0,65 г (1 капля) ртути (5. 2.1) или 0,7 г окиси ртути (II) (5.2.2). Вместо этого можно применить 0,3 г окиси меди (II) (5.2.3) или 0,9-1,2 г пятиводного сульфата меди (II) (5.2.4). Установлено, что при этом для полного обнаружения азота требуется более длительное сжигание.

Примечание. Когда анализируются продукты с высоким содержанием азота, в качестве катализатора лучше использовать ртуть.


Добавляют 25 см серной кислоты (5.3) для первого грамма сухого вещества навески и 6-12 см на каждый дополнительный грамм сухого вещества (для сжигания крахмала и жира требуется около 6 и 12 см кислоты, соответственно). Тщательно перемешивают, чтобы полностью смочить навеску. Сначала колбу нагревают умеренно, чтобы предотвратить поднятие пены до горла колбы или ее выбрасывание из колбы.

Примечание. Желательно добавить антипенообразующее вещество, как, например, парафиновую смолу (5.4).


Нагревают умеренно, поворачивая время от времени до тех пор, пока масса не обуглится и не исчезнет пена. Затем нагревание усиливают до тех пор, пока не установится равномерное кипение. Нагрев является достаточным, если кипящая кислота конденсируется в середине горла колбы Кьельдаля. Следует избегать перегрева стенок колбы, не находящихся в контакте с жидкостью. Если используют открытое пламя, такой перегрев можно предотвратить путем установления колбы на лист асбеста с отверстием диаметром немного меньше, чем диаметр колбы на уровне жидкости.

Во время нагревания колба должна быть установлена наклонно под углом 30-45° к вертикали.

После осветления жидкости продолжают нагревание в течение 1 ч в случае использования ртутного катализатора или 2 ч в случае использования медного катализатора.

Оставляют остывать. Если холодный минерализат застывает, рекомендуется использовать для сжигания больший объем кислоты, чем указано выше.

8.2.2 Отгонка аммиака

Осторожно добавляют 250-350 см воды для полного растворения сульфатов, перемешивают круговыми движениями и оставляют остывать. Добавляют немного вещества, предотвращающего выбрасывание (5.13). Пипеткой переносят в приемную колбу отгонного аппарата 25 см раствора серной кислоты (1/2)=0,05 или 0,125 моль/дм (5.9.1). Концентрацию кислоты выбирают в зависимости от ожидаемого содержания азота в навеске (примечание к п.8.1), добавляют 100-150 см воды и несколько капель смешанного индикатора (5.11).

Кончик трубки холодильника погружают в жидкость, содержащуюся в приемной колбе, на глубину не менее 1 см. Медленно по стенкам в колбу Кьельдаля вводят 100 см раствора гидроксида натрия (5.7).

Примечание. Если серной кислоты (5.3) было использовано больше, чем указано (8.2.1, последний абзац), следует пропорционально увеличить объем гидроксида натрия.


Если в качестве катализатора использовались соединения ртути, раствор гидроксида натрия до внесения в колбу смешивают с 25 см раствора тиосульфата (5.8.1).

Примечание. Если добавлять отдельно, тиосульфат может вступить в реакцию с кислотой в колбе с образованием сульфида водорода, что приводит к искажению результатов. Вместо тиосульфата можно использовать гипофосфит (5.8.2). В этом случае нет опасности образования сульфида водорода. 1 г гипофосфита, добавленного в твердом виде после разбавления водой до приливания щелочи, достаточно для осаждения 1 г ртути.

Колбу немедленно присоединяют к отгонному аппарату и нагревают с такой интенсивностью, чтобы за 30 мин собрать 150 см дистиллята. После этого лакмусовой бумагой (5.12) проверяют рН дистиллята на кончике трубки холодильника. Если реакция щелочная, продолжают дистилляцию.

Кончик трубки холодильника сразу после окончания дистилляции вынимают из холодильника, чтобы предотвратить обрат

ГОСТ 13496.4-2019 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина

Текст ГОСТ 13496.4-2019 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания азота и сырого протеина

>

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ (МГС)

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC)

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Методы определения содержания азота и сырого протеина

Издание официальное

Москва Стандартинформ 2019

ГОСТ 13496. 4—2019

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственном стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

• 1 РАЗРАБОТАН Акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АО «ВНИИКП»)

• 2 ВНЕСЕН Межгосударственным техническим комитетом по стандартизации МТК 4 «Комбикорма. белково-витаминные добавки, премиксы»

• 3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июля 2019 г. № 120-П)

За принятие проголосовали:

Кратко* наименование страны no МК (ИСО 316В) 004-97	Код страны по МК(ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстамдарт
Россия	RU	Росстацдарт
Узбекистан	UZ	Уэстандарт

• 4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 августа 2019 г. Ne 488-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.4—2019 введен в действие в качестве на* ционального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2020 г.

• 5 ВЗАМЕН ГОСТ 13496.4—93

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»

© Стандартинформ. оформление. 2019

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве офи* циального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

• 1 Область применения

• 2 Нормативные ссылки

• 3 Требования безопасности. ………………….

• 4 Условия проведения испытаний

• 5 Требования к квалификации оператора

• 6 Отбор проб

• 7 Подготовка проб

• 8 Титриметримеский метод определения содержания азота по Кьельдалю (основной метод)

• 9 Фотометрический индофенольный метод определения азота

ГОСТ 13496.4—2019

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Методы определения содержания азота и сырого протеина

Fodder, Mixed fodder and raw mixed fodder. Methods of nitrogen and crude protein determination

Дата введения — 2020—08—01

Настоящий стандарт распространяется на все виды кормов, комбикормов и комбикормового сырья, за исключением сырья минерального происхождения, кормовых дрожжей и паприка, и устанавливает титриметрический (по Кьельдалю) и фотометрический методы определения азота с последующим пересчетом результатов на сырой протеин.

Нижний предел измерения массовой доли азота — 0,016 %.

Данные методы не позволяют различить белковый и небелковый азот.

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 8.135 Государственная система обеспечения единства измерений. Стандарт-титры для приготовления буферных растворов — рабочих эталонов pH 2-го и 3-го разрядов. Технические и метрологические характеристики. Методы их определения

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей эоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробеэопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.2.007.0 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12. 4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 83 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 1770 (ИС01042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

Издание официальное

ГОСТ ИСО 3310-Г Сита контрольные. Часть 1. Сита контрольные из металлической проволочной ткани. Технические требования и испытания

ГОСТ 3773 Реактивы. Аммоний хлористый. Технические условия

ГОСТ 3626 Сетки проволочные тканые с квадратными ячейками. Технические условия

ГОСТ 4145 Реактивы. Калий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4146 Реактивы. Калий надсернокислый. Технические условия

ГОСТ 4165 Реактивы. Медь II сернокислая 5-вадная. Технические условия

ГОСТ 4166 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4232 Реактивы. Калий йодистый. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-6—2003¹’ Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 5845 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-водный. Технические условия

ГОСТ 5962 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ ISO 6497 Корма. Отбор проб

ГОСТ ISO 6498 Корма, комбикорма. Подготовка проб для испытаний

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9656 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 10652 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N. N. N’. N’-тетрауксусной кислоты 2-водная (трипом Б). Технические условия

ГОСТ 10929 Реактивы. Водорода пероксид. Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0 Комбикорма, комбикормовое сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13586.3 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 13979.0 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17681 Мука животного происхождения. Методы испытаний

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Тилы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 27668 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 28311 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227 (ИСО 835¹1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29251 (ИСО 385-1—84} Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации. метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым s государствах, указанных 8 предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

При подготовке и проведении испытаний должны быть соблюдены следующие условия:

К выполнению испытаний и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное образование и опыт работы в химической лаборатории, прошедшего инструктажи на рабочем месте по электробезопасности. противопожарной безопасности, освоившего метод в процессе обучения и выполнившего нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля точности испытаний.

Отбор проб — по ГОСТ ISO 6497. ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3. ГОСТ 13979.0. ГОСТ 17681. ГОСТ 27668.

Подготовка проб — по ГОСТ ISO 6498.

Испытуемую пробу измельчают до прохода через сито с размером стороны ячейки 1 мм.

Подготовленные пробы хранят в стеклянных или пластмассовых емкостях с крышками в сухом месте.

(основной метод)

Сущность метода заключается в минерализации органического вещества пробы кипящей серной кислотой в присутствии катализатора с образованием сернокислого аммония, добавлении к охлажденному минерализату избытка гидроокиси натрия для выделения аммония, отгонке и титровании выделенного аммиака, вычислении массовой доли азота в испытуемой пробе и пересчете на массовую долю сырого протеина.

• 8.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности ±0,001 г.

Установка типа Къельдаля (см. рисунок 1) или аппарат для отгонки аммиака с водяным паром (см. рисунок 2).

1 — парообразователь {колба К-1—1000(2000}—29/32 <34/35. 45/40) ТС или колба П-1-1000-42 по ГОСТ 25336}. 2 — воронка ВК-100 ХС по ГОСТ 25336. 2 — каплеуловитель исполнения КО-60 ХС по ГОСТ 25336; 4 — холодильник ХШ (ХПТ>3-400-19/26 (29/32) по ГОСТ 25336; S — колба Кн-2-250-19/26 (29/32) ТХС по ГОСТ 25336: 6 — подъемный столик; 7 — колбонатремтель

Рисунок 1 — Установка типа Кьельдаля

1 — колба Ки-2-250-19/26 <29/32) ТХС по ГОСТ 25336.2 — холодильник ХШ <ХЛТ)-3-40В-19/26 (29/32) по ГОСТ 25336.3 — каплеуловитель исполнения КО-60 ХС по ГОСТ 25336; 4 — отгонная колба; 5. 9 — воронка ВК-100 ХС по ГОСТ 25336. 8. 7. 8 — краны; ТО — парообрааователь. колба К-1-1000(2000)-29/32 (34/35.45/40) ТС или колба П-1-1000-42 по ГОСТ 25336

Рисунок 2 — Аппарат для отгонки аммиака с водяным паром

Колбы Къельдаля 1(2>-100(250. 500)-29/32 ТСХ по ГОСТ 25336.

Установка для титрования с бюреткой 1-1<2>—2-10(25. 50J-0.1 по ГОСТ 29251.

Капельница для индикатора по ГОСТ 25336.

Ступки фарфоровые и пестик по ГОСТ 9147.

Электроплита по ГОСТ 14919 или другое оборудование для «мокрого озоления», позволяющие поддерживать температуру 450 *С—500 ’С.

Воронки стеклянные В—25(36>—38(50, 80) ХС по ГОСТ 25336 или втулки Къельдаля.

Колбы мерные 1(1, 2.2а}-(500,1000}-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры 1(2>-50(1000)~2 по ГОСТ 1770.

Стаканы В-1(2}-50 ТХС по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные 1(2, 3.5)—1 (1а. 2.2а)-2-1(25) по ГОСТ 29227.

Кружка фарфоровая 3 по ГОСТ 9147.

Асбест листовой.

Средства для равномерного кипения, такие как гранулированная пемза, кусочки фарфора, стеклянные шарики диаметром от 5 до 7 мм. промытые в концентрированной соляной кислоте и дистиллированной воде и прокаленные.

Сито с размером стороны квадратных ячеек 1 мм по ГОСТ 3310-1 или сито из сетки по ГОСТ 3826 с размером стороны квадратных ячеек 1 мм.

Кислота серная по ГОСТ 4204. ч. д. а.

Кислота серная, стандарт-титр молярной концентрации c(H₂SO₄) = 0.05 моль/дм³ по ГОСТ 8.135.

Калий сернокислый по ГОСТ 4145, ч. д. а.

Калий надсернокислый по ГОСТ 4146. ч. д. а.

Медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165. ч. д. а.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, ч. д. а.

Селен, ч.

Перекись водорода по ГОСТ 10929. с массовой долей 30 %, ч. д. а.

Кислота борная по ГОСТ 9656. х. ч.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. ч. д. а.

Натрия гидроокись, стандарт-титр молярной концентрации с (NaOH) = 0.1 моль/дм³ по ГОСТ 8.135.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Метиловый красный.

Метиловый голубой или бромкрезоловый зеленый.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

• 1 Допускается испогъзовзнив других средств измерений, не уступающих вышеуказанным по метрологическим характеристикам.

• 2 Допускается использование реактивов аналогичной квалификации.

Катализатор 1. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди. 100 весовых частей сернокислого калия и две весовые части селена, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

Катализатор 2. Смешивают 10 веоовых частей сернокислой меди и 100 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять сернокислый калий надсернокислым калием или сернокислым натрием в том же количестве.

Аморфный или растертый селен, из расчета 5 г на 1 дм³ серной кислоты, растворяют при нагревании в концентрированной серной кислоте в термостойкой колбе до обесцвечивания.

Используют стандарт-титр серной кислоты. Раствор готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.

Допускается приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации c(H₂SO₄) = = 0.05 моль/дм³ из концентрированной серной кислоты в соответствии с ГОСТ 25794.1.

Примечание — Допускается использование раствора серной кислоты другой молярной концентрации аналогичной точности, при этом в расчеты необходимо внести соответствующие коэффициенты.

40 г борной кислоты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 см³. После охлаждения объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

При титровании применяют один из следующих индикаторов.

• индикатор 1: растворяют 0.20 г метилового красного и 0.10 г метиленового голубого в 100 см³ 96 %-ного раствора этилового спирта;

• — индикатор 2: смешивают три объема 0.1 %-ного раствора бромкрезолового зеленого в этиловом спирте и один объем 0. 2 %-ного раствора метилового красного в этиловом спирте.

Хранят индикаторы в посуде из темного стекла.

330 г гидроокиси натрия растворяют в фарфоровой кружке в 670 см³ дистиллированной воды.

400 г гидроокиси натрия растворяют в фарфоровой кружке в 600 см³ дистиллированной воды.

Используют стандарт-титр гидроокиси натрия. Раствор готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.

Допускается приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = 0,1 моль/дм³ в соответствии с ГОСТ 25794.1.

В чистую сухую колбу Къельдаля помещают 0.7—1 г комбикормов, кормов растительного происхождения. 0.3—0.5 г муки животного происхождения, взвешенных с погрешностью не более 0.001 г.

Примечание — Для проб растительного происхождения с большим содержанием сырого протеина, например шрота, допускается уменьшение навески до 0.4 г.

Минерализацию осуществляют в вытяжном шкафу одним из двух способов:

• — способ 1: добавляют в колбу Къельдаля 2 г катализатора 1 или 8 г катализатора 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10—12 см³ концентрированной серной кислоты в зависимости от массы навески;

• — способ 2: добавляют в колбу Къельдаля 10 см³ перекиси водорода с массовой долей 30 % в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции приливают такое же количество концентрированной серной кислоты. Для ускорения сжигания рекомендуется использовать серную кислоту, содержащую селен (см. 8.3.1.3).

Содержимое колбы Къельдаля тщательно перемешивают легкими круговыми движениями, обеспечивая полное смачивание навески. Колбу устанавливают на нагреватель так. чтобы ее ось была наклонена под углом 30*—45’ к вертикали, в горло колбы вставляют маленькую стеклянную воронку или втулку для уменьшения улетучивания кислоты во время минерализации. Вначале колбу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразование.

Примечания

• 1 При использовании специального оборудования для сжигания проб следуют указаниям инструкции к нему.

• 2 Во избежание бурного пенообраэования допускается использование пеногасителей, таких как парафин или 30 %-ная водная эмульсия силикона, а также средства для равномерного кипения.

При нагревании содержимое колбы время от времени помешивают вращательными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усиливают, избегая перегрева стенок колбы, не соприкасающихся с жидкостью, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. Если используют открытое пламя, то такой перегрев можно предотвратить, помещая колбу на лист асбеста с отверстием. по диаметру несколько меньшим, чем диаметр колбы на уровне жидкости. Нагрев считается нормальным, если пары кислоты конденсируются ближе к середине горла колбы Къельдаля.

После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают в течение 30 мин. После охлаждения минералиэат количественно переносят в отгонную колбу, три раза ополаскивают колбу Къельдаля порциями по 20—30 см³ дистиллированной воды. Общий объем раствора в отгонной колбе должен составлять 200—250 см³.

Допускается проводить отгонку непосредственно из колбы Къельдаля. В этом случае для минерализации используют колбу Къельдаля вместимостью 500 см³. Перед отгонкой аммиака минералиэат разбавляют 150—200 см³ дистиллированной воды.

При проведении экспресс-анализа на комбикормовых предприятиях и в период заготовки травянистых кормов допускается следующий способ приготовления минералиэата.

Навеску испытуемой пробы массой 0.2—0.3 г помещают в колбу Къельдаля. или в пробирку, или в колбу из термостойкого стекла. В колбу с навеской добавляют 4 см³, а в пробирку — 3 см³ перекиси водорода с массовой долей 30 %. Через 1,5—2 мин в колбу добавляют 5—8 см³, а в пробирку — 2 см³ концентрированной серной кислоты, содержащей селен (см. д.3.1.3). Содержимое колбы или пробирки тщательно перемешивают для полного смачивания навески.

Колбу или пробирку с навеской помещают на электроплиту и нагревают до кипения. Затем нагрев увеличивают и минерализацию продолжают до полного обесцвечивания раствора (20—30 мин). Если раствор не осветлился, то нагревание продолжают еще 5—В мин или охлаждают, приливают 0,5 см³ перекиси водорода с массовой долей 30 % и кипятят до полного обесцвечивания.

После охлаждения минералиэат количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. В отгонную колбу переносят 50 см³ раствора минералиэата.

8 приемную колбу наливают 25—30 см³ раствора борной кислоты массовой концентрации 40 г/дм³ и пять капель любого из смешанных индикаторов. Колбу подставляют под холодильник так. чтобы его кончик был ниже поверхности раствора борной кислоты не менее чем на 1 см. Через холодильник пропускают холодную воду.

Отгонную колбу присоединяют к аппарату для отгонки аммиака и через капельную воронку осторожно приливают в колбу с минерализатом раствор гидроокиси натрия с массовой долей 33 %. Воронку промывают два-три раза порциями по 10—15 см³ дистиллированной воды, оставляя небольшое количество воды в качестве гидрозатвора. Допускается прибавлять раствор гидроокиси натрия до присоединения отгонной колбы к аппарату. В этом случае раствор гидроокиси натрия наливают в отгонную колбу по стенке, стараясь не перемешивать его с минерализатом. и сразу присоединяют к аппарату для отгонки аммиака.

Объем приливаемой гидроокиси натрия зависит от объема серной кислоты, использованной для приготовления минералиэата. На каждый кубический сантиметр серной кислоты, оставшейся после окончания процесса минерализации, следует добавлять не менее 3.5 см³ раствора гидроокиси натрия с массовой долей 33 %. Если объем оставшейся серной кислоты трудно установить, объем щелочи рассчитывают исходя из объема серной кислоты, взятой для минерализации. Допускается предварительная нейтрализация содержимого отгонной колбы раствором гидроокиси натрия с массовой долей 40 %, используя любой из индикаторов. Для обеспечения выделения аммиака добавляют дополнительно 1 см³ раствора гидроокиси натрия с массовой долей 40 %.

Раствор в отгонной колбе нагревают так. чтобы обеспечить равномерное кипение. Допускается проводить отгонку водяным паром. Чтобы исключить выделение аммиака, вода в парообразователе должна быть подкислена серной кислотой до фиолетовой окраски при применении индикатора 1 и розовой — при применении индикатора 2.

8 начале отгонки аммиака цвет раствора в приемной колбе меняется на зеленый. При нормальном кипении объем раствора в приемной колбе через 20—30 мин обычно составляет 150—200 см³. При проведении экспресс-анализа время отгонки сокращается до 7—10 мин. Конец отгонки можно установить с помощью красной лакмусовой бумажки. Для этого приемную колбу отставляют от аппарата, предварительно обмыв конец холодильника дистиллированной водой, и подставляют лакмусовую бумажку под стекающие капли дистиллята. Если лакмус не синеет, отгон аммиака закончен. Если лакмус синеет, приемную колбу снова подставляют лсд холодильник и продолжают отгонку.

После окончания отгонки приемную колбу опускают и обмывают сливную трубку холодильника дистиллированной водой в приемную колбу.

Аммиак титруют из бюретки раствором серной кислоты (см. 8.3.1.4) до перехода окраски индикатора от зеленом в фиолетовую при применении индикатора 1 и от зеленой в розовую при применении индикатора 2.

В приемную колбу наливают 50 см³ раствора серной кислоты (см. 8.3.1.4). Отгонку ведут способом. указанным в 8.4.2.1. После окончания отгонки содержимое приемной колбы (избыток раствора серной кислоты) титруют раствором гидроокиси натрия (см. 8.3.1.9) до перехода окраски в зеленую.

• 8.4.3 Одновременно с проведением испытания испытуемой пробы проводят контрольный опыт на загрязнение воды и реактивов аммиаком в соответствии с 8.4.1 и 8.4.2. исключая взятие навески корма.

Объем серной кислоты, израсходованный на титрование в контрольном опыте при отгонке в борную кислоту, не должен превышать 0. 5 см³. При отгонке в серную кислоту объем раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование, должен быть не менее 49.5 см³. В случае несоблюдения вышеуказанных объемов выявляют источники загрязнения реактивов аммиаком и

Корма растительные. Метод определения расщепляемости сырого протеина

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

КОРМА РАСТИТЕЛЬНЫЕ

Метод определения расщепляемости сырого протеина

Vegetable feeds. Method for determination of crude protein splitting

ОКСТУ 9709

Дата введения 01.01.90

Настоящий стандарт распространяется на зеленые корма, сено, силос, мякину, сенаж, солому, искусственно высушенные травяные корма, корнеплоды, сушеные отходы промышленной переработки растительного сырья (барда, мезга, дробина, жом) и устанавливает метод определения расщепляемости сырого протеина в испытуемой пробе.

Метод применяется также при определении расщепляемости протеина в комбикормах и комбикормовом сырье.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

Отбор проб — по ГОСТ 27262, ГОСТ 13496.0.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСЩЕПЛЯЕМОСТИ СЫРОГО ПРОТЕИНА

2.1.    Сущность метода заключается в инкубации корма, положенного в мешочек из синтетической ткани и помещенного в рубец взрослых жвачных животных, и определении азота в испытуемой пробе корма до и после его инкубации.

2.2.    Аппаратура, материалы Измельчитель проб растений ИПР-2, соломорезка ИСР-1.

Мельница лабораторная марки МРП-2 и других аналогичных марок.

Ножницы.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104* 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания

500 г.

Шкаф сушильный.

Нить синтетическая.

Сито металлическое диаметром отверстий 1 мм.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

Ступка фарфоровая с пестиком.

Мешочки из синтетической ткани по действующей нормативно-технической документации (арт. 56159, 56326).

Леска капроновая с поперечным сечением 0,6—0,8 мм.

Фистулы рубца диаметром не менее 45 мм.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечание. Допускается использовать аппаратуру и другие средства измерения, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.

Издание официальное

* С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.

Перепечатка воспрещена

2.3. Подготовка к испытанию

2.3.1.    Подготовка проб к испытанию

2.3.1.1.    Объединенные пробы сена, силоса, сенажа, соломы и зеленых кормов измельчают на отрезки длиной 1—3 см. Корнеплоды и клубнеплоды измельчают на пластинки (ломтики) толщиной до 0,8 см. Из объединенной пробы, разделенной на четыре треугольника, выделяют среднюю пробу массой 150 г.

2.3.1.2.    Среднюю пробу зеленых кормов, силоса и сенажа измельчают ножницами на отрезки длиной не более 5 мм. Из средней пробы выделяют ее часть массой около 70 г, которую дополнительно измельчают ножницами на отрезки длиной не более 3 мм.

2.3.1.3.    Среднюю пробу сена, соломы, искусственно высушенных травяных кормов, комбикормов и комбикормового сырья, отходов промышленной переработки растительного сырья измельчают на мельнице и просеивают через сито диаметром отверстий 1 мм. Трудноизмельчимый остаток на сите после дополнительного измельчения вручную ножницами или в ступке добавляют к просеянной части и тщательно перемешивают.

2.3.2. Подготовка к испытанию

2.3.2.1.    Для проведения испытаний подбирают по принципу аналогов три головы кастрированных бычков средней живой массой не менее 250 кг или три головы взрослых овец (валухов) средней живой массой не менее 40 кг.

Взрослому крупному рогатому скоту или овцам накладывают постоянные фистулы рубца диаметром не менее 45 мм. Продолжительность послеоперационного периода 3 недели.

2.3.2.2.    Животных за 2 недели до начала испытаний и в период испытаний содержат на рационе, состоящем по питательности из 70 % объемистых кормов (35 % сена + 35 % силоса) и 30 % концентратов или из 70 % зеленого корма и 30 % концентратов. Концентраты должны включать не менее трех источников протеина. Общее содержание сырого протеина в рационе должно быть не менее 13 % по сухому веществу. Уровень кормления животных — поддерживающий плюс 5 % (в зависимости от живой массы животных, МДж). Кормление животных двукратное с минимальным интервалом 8 ч.

2.3.2.3.    Подготовка мешочков

Мешочки прямоугольной формы с закругленными углами сшиваются синтетической нитью двойным швом плотным стежком. Размер мешочков 5×11 см.

2.4.    Проведение испытания

2.4.1.    Из тщательно перемешанной пробы, подготовленной по и. 2.3.1, берут навеску корма массой 8 г, а из пробы, подготовленной по и. 2.3.1.3, — навеску массой 3 г.

Навеску помещают во взвешенный и пронумерованный мешочек, зашивают (или плотно завязывают). Связку мешочков (не более 6 шт.), нанизанных на леску длиной 65—70 см для овец и 75—90 см для крупного рогатого скота, помещают в фистулу в рубец опытного животного сразу после кормления. Мешочки с пробами сухих кормов перед закладкой в фистулу погружают на 1 мин в теплую дистиллированную воду. Продолжительность инкубации корма в мешочке — 6 ч, а для грубых кормов — 24 ч. По истечении срока инкубации мешочки извлекают, промывают под струей воды не менее 3 мин (до чистой воды), разминая пальцами содержимое мешочка, а затем однократно в дистиллированной воде. Мешочки подсушивают на фильтровальной бумаге и доводят в сушильном шкафу при температуре 65 °С до постоянной массы. Высушенные мешочки взвешивают, тщательно перемешивают их содержимое и берут навеску массой 500 мг для определения содержания азота в сухом веществе остатка.

Определение содержания общего азота в сухом веществе остатка корма после его инкубации проводят по ГОСТ 13496.4 из одной и той же пробы корма.

2.5.    Обработка результатов

2.5.1.    Содержание общего азота и азота остатка корма определяют в сухом веществе в двух параллельных повторностях для каждого животного. За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов шести определений. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

50

Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений (с!) не должны превышать значения, вычисленного по формуле

d= 3,49 + 0,19 • X,

где 3,49; 0,19 — постоянные коэффициенты;

X— среднее арифметическое результатов шести определений.

Содержимое азота в сухом веществе остатка корма (X) в мг вычисляют по формуле

У_(СБ -XQ 100

где СВ — содержание сухого вещества в остатке корма после инкубации, мг;

Ху — содержание азота в остатке корма после инкубации, мг.

2.5.2. Содержание расщепленного сырого протеина в испытуемой пробе (Х₂) в мг вычисляют по формуле

Х₂ = (Х₃-Х)- 6,25,

где Х₃ — содержание общего азота в сухом веществе навески корма, мг;

6,25 — постоянный коэффициент.

2.5.3. Расщепляемость сырого протеина (АД в процентах вычисляют по формуле

~~ Х₃ -6,25 ‘

51

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1.    РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Госагропромом СССР РАЗРАБОТЧИКИ

В.Г. Игловиков, Н.С. Усанкин, Н.Г. Григорьев, А.И. Фицев, Ф.В. Воронкова, В.Д. Кальниц-кий, А.М. Материкин, В.В. Турчинский

2.    УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 29.03.89 № 847

3.    ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4.    ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

5.    Ограничение срока действия снято по протоколу № 4—93 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 4—94)

6.    ПЕРЕИЗДАНИЕ

52

Расчет показателей для анализа рациона

Начинают расчет с определения структуры рациона.

Структура рациона

— процентное соотношение отдельных кормов или их групп, рассчитанное от ЭКЕ.
Дело в том, что при балансировании рациона корма изменяется количество кормов в рационе, а следовательно и его структура. Поэтому расчет структуры рациона — это обязательный элемент анализа.
Обычно при анализе выделяют четыре группы кормов: грубые (ГК), сочные (СК), концентрированные (КК) и корма животного происхождения (КЖП).
Рассчитывают структуру по формуле, в %:
$$ ГК= \frac{ЭКЕ_{ГК}}{ЭКЕ_{ИТОГО}} *100 $$
То есть чтобы посчитать долю грубых кормов в рационе, нужно количество ЭКЕ грубых кормов в рационе умножить на 100% и разделить на ЭКЕ по итого в рационе.
или если вести расчет по сухому веществу
$$ ГК=\frac{СВ_{ГК}}{СВ_{ИТОГО}} *100 $$
Аналогично рассчитываем долю сочных, концентрированных кормов и кормов животного происхождения.
Полученную структуру сравнивают с рекомендуемой для данного вида животных и делают заключение. Рекомендуемая структура является физиологичной для животного, то есть при соблюдении структуры рациона происходит нормальное переваривание корма.

Например, Свиньи трудно переваривают грубые корма, избыток клетчатки существенно снижает переваримость рациона, поэтому эту группу кормов ограничивают не более 10%. Для крупного рогатого скота объемистые корма занимают от 50 до 75% по структуре, однако эти корма обладают разными свойствами. В рационе дойных коров допускается до 50% сочных кормов, которые являются молокогонными, в рационе сухостойных и нетелей –до 35% грубых, это стимулирует уменьшение молокоотдачи и профилактирует развитие мастита у животных.
В начало

Тип кормления

— преобладающий вид корма по ЭКЕ или обменной энергии, среди кормов той группы, которая в структуре преобладает. В приведенном выше примере преобладают сочные корма — 51,77%, значит именно они будут определять тип кормления. Данный рацион имеет силосно-сенажно-корнеплодный тип.

Различают следующие типы кормления: сенной, сено-соломистый — при содержании грубых кормов 50% и более; силосный, силосно-сенажный, силосно-сенажно-корнеплодный -при содержании сочных кормов 50% и более; травянистый — при содержании зеленых кормов 50% и более; концентратный — при содержании концентратов 40% и более в рационе крупного рогатого скота и 75% и более — в рационе свиней. Если в структуре рациона грубые корма, сочные корма или зеленые корма занимают менее 50%, концентраты менее 40%, то тип кормления определяют по процентному соотношению различных видов кормов, которые записываются в порядке уменьшения.

Тип кормления показывает, какие корма являются основными в рационе и определяют его питательность. Поэтому если при анализе рациона получился тип кормления, не характерный для животного, следует разобраться, какие причины привели к изменению типа кормления и не является ли это основным фактором снижения продуктивности.

Обратите внимание, что у крупного рогатого скота тип кормления может меняться в течении года. У нетелей, в сухостойный период он как правило сенной или сено-концентратный, в период раздоя -концентратный, а в основной период продуктивности — сочный, силосно-сенажный или силосно-сено-концентратный. Каждый из этих типов физиологичен и обуславливает нормальную продуктивность.
В начало

Все показатели, которые рассчитываются далее, рассчитываются сначала по столбцу ИТОГО, а затем по столбцу НОРМА.
т.е. форма записи должна иметь такой вид:
Название показателя [цифра рассчитанная по столбцу ИТОГО], при норме [цифра рассчитанная по столбцу НОРМА]
Например,
Уровень кормления 2,3, при норме 1,4
Цифра, рассчитанная по столбцу норма позволяет оценить, какой уровень показателя должен быть в рационе при данном значении продуктивности.
Расчёт по норме можно заменить сравнением с нормативными показателями, согласно литературным данным.
Но каждый принцип сравнения имеет свои недостатки.

Уровень кормления

— количество потребленных кормов в расчете на каждые 100кг живой массы.
$$ \frac {ЭКЕ *100} {Живая \; масса, кг} = \frac{ОЭ *10}{Живая \; масса, кг} $$
Расчет так же можно провести пропорцией:
Уровень кормления — 1.74ЭКЕ на 100кг живой массы (средний), при норме 1,69ЭКЕ на 100кг живой массы. Уровень кормления рассчитывают только для крупного рогатого скота.

Избыток энергии в рационе способствует лучшему усвоению питательных веществ, может приводить к ожирению животных. Именно высокоэнергетические рационы характерны для откорма животных, в то время как для телят избытка энергии допускать не следует.
Высокий уровень кормления приводит к большим затратам корма и энергии и для хозяйства экономически невыгоден.
В начало

Количество сухого вещества на 100 кг живой массы.

— этот показатель характеризует объем рациона.
Рассчитать его можно по формуле:
$$ \frac{Сухое \; вещество, \; (кг)*100}{живая \;масса, \; кг} $$
Пищеварительный тракт животного имеет определенную вместимость, которая зависит от биологических особенностей, возраста, типа кормления, но в то же время этот показатель обладает и закономерностью. Например, для КРС в среднем требуется 3 кг сухого вещества, для лошадей 2,5 кг на 100 кг живой массы. Избыток сухого вещества приводит к недостатку ферментов, снижению переваримости, завалу ЖКТ и как следствие снижению продуктивности.

Недостаток же сухого вещества приводит к более быстрому перевариванию корма. Если провести аналогию с человеком, то нехватка сухого вещества аналогична ощущениям человека, съевшего шоколадку: Калорийность шоколадки приблизительно покрывает 1/4 часть от потребности в энергии у взрослого человека, то есть логично предположить, что чувство сытости у человека после шоколада должно быть как минимум несколько часов. Однако, из-за высокой переваримости и энергетической ценности шоколадка быстро переваривается и возникает чувство голода. Замедлить всасывание шоколада и создать искусственное чувство сытости можно съев с шоколадкой отруби, которые содержат большое количество клетчатки и дают чувство сытости).
В начало

Количество переваримого протеина на 1 ЭКЕ.

$$ \frac {ПП (г)}{ЭКЕ} = \frac{ПП(г)*10}{ОЭ(МДж)} $$
Уровень протеина в рационе — один из ключевых показателей для растущих и откармливаемых животных. С одной стороны в рационе должно быть достаточное количество протеина, чтобы обеспечить нормальный рост и развитие организма молодняка или плода у беременных животных, или восстановления тканей у взрослых животных, а с другой нужно понимать, что при высоком уровне протеина в рационе важно не допустить избытка энергии, что может привести к нарушению обменных процессов в организме. У коров при избытке протеина, энергии и дефиците сахара — то есть включении в рацион большого количества концентратов возможно развитие алкалозов и кетозов.

При недостатке протеина нарушается рост и развитие, замедляется формирование мышечной ткани, а значит уменьшаются приросты живой массу у молодняка, плода у стельных животных и др. Важно понимать, что как избыточное количество, так и недостаточное количество протеина в рационе вредно для животного.
В начало

]]>

Сахаро-протеиновое отношение — СПО

$$ \frac {Сахар(г)}{ПП(г)} $$
Сахаро-протеиновое отношение (рассчитывается у КРС) — важный показатель протеинового питания. Важно понимать, что для нормально пищеварения соотношение питательных веществ так же важно, как и их избыток или недостаток.
В норме у КРС в среднем сахаро-протеиновое (СПО) отношение 1:1, то есть на 1 грамм сахара приходится 1 грамм протеина. При снижении уровня сахара происходит уменьшение усвоения протеина в рубце, увеличиваются потери азота и значительная часть протеина не усваивается животным. При избытке сахара он вступает в конкурентные отношения с крахмалом и усвоение сложных углеводов снижается.
Сахаро-протеиновое отношение, как показатель, используется только в Российской школе кормления. По мнению зарубежных ученых (в частности, сейчас в РФ набирают популярность немецкие нормы кормления), важно не сколько СПО, сколько уровень суммы сахара и крахмала в сухом веществе.
СПО в рационе коров на практике составляет в среднем 0,3-0,4, при норме 0,8:1. Повысить этот показатель можно путем введения дорогой свеклы (Сахар 120-150 г/кг) или патоки (мелассы свекловичной, сахар 500 г / кг). Высокопродуктивным коровам по нормам Калашникова, 2003 нужно больше 2 кг патоки. То есть выше предельной дачи. Избыток сахаров в рационе может вызывать диарею у коровы, а значит снизить усвоение рациона в целом.
Таким образом, применение патоки с точки зрения европейского подхода может оказывать негативное влияние на организм коровы. Поэтому и учитывают сумму сахара и крахмала. Недостаток сахара приводит к изменению углеводного обмена в рубце и расщеплению более сложных углеводов (крахмала). За счет этого происходит компенсация недостатка сахара в рационе. В среднем количество суммы сахар+крахмал составляет 25% от сухого вещества рациона и может колебаться в зависимости от периода лактации.

Замечание:
Замечание о Европейском подходе к кормлению животных (более подробно можно почитать на сайте soft-agro.com]]>). Действительно, фактическое СПО редко поднимается выше 0,3-0,4, при этом животные показывают продуктивность значительно ниже плановой. Европейские нормы учитывают более низкое содержание сахара в рационе. (см таблицу)

Проблема дефицита углеводов в рубце решается путем смещения пищеварения в пользу расщепления более сложных углеводов — крахмала и частично НДК. Поэтому вводиться новый показатель: сумма крахмала и сахара в сухом веществе
$$ \frac {Сахар(г)+крахмал (г)}{СВ(кг)} :10 $$
Однако, независимо от того, какими путями обеспечивается уровень углеводов в рубце, их недостаток приводит к потере ращепляемого протеина, а следовательно снижению синтеза микробиального белка. Поэтому при анализе рациона следует учитывать качественный состав протеина (РП и НРП), особенности его пищеварения.
Например, избыток пропионовой кислоты, образующейся при расщеплении крахмала может приводить к ожирению животных, а избыточное содержание белка — дефициту глюкозы по принципам, сходным таковым у диабета, а затем и к развитию кетоза и ацидоза. То есть включение в рацион большого количества концентратов — как источников крахмала, требует контроля рубцового пищеварения у животных, обеспечения оптимальной энергонасыщенности рациона и др. факторов.

Одним из логическим продолжением описанного подхода в анализе углеводного питания стал показатель отношение сумму крахмала и сахара к переваримому протеину
$$ \frac {Сахар(г)+крахмал (г)}{ПП(г)} $$
Интерпретировать этот показатель нужно так же, как и сахаро-протеиновое отношение.
В начало

Протеиновое отношение — ПО

$$ ПО= \frac {2,25*ПЖ(г)+ПК(г)+ПБЭВ}{ПП(г)} $$
Протеиновое отношение один из показателей, рассчитываемых в «классическом» кормлении для характеристики отношения азотсодержащей и безазотистой части корма.
Протеиновое отношение бывает

• меньше 6 — узким — для высокопродуктивных животных, молодняка
• 6-8 — средним — для животных со средней продуктивностью
• больше 8 — широким — для животных на откорме

В начало

$$ \frac {Кальций(г)}{Фосфор(г)} $$
Аналогичная ситуация и с кальциево-фосфорным отношением. При избытке одного из элементов снижается усвоение другого.
Обратите внимание, что кальциевый-фосфорное отношение у крупного рогатого скота может достигать 6 : 1 без вреда для здоровья для животного (по данным Дмитроченко). Фактором развития рахита (остеомаляции) в данном случае оказывается не избыток кальция (который не всасывается в кишечнике и выходит с калом), а недостаток фосфора, который лимитирует усвоение кальция. Таким образом, высокое кальциево-фосфорное отношение нужно рассматривать с учетом наличия недостатка фосфора, дефицита витамина Д и избытка конкурирующих микронутриентов.

Уровень сырой клетчатки в СУХОМ веществе, %.

$$ \frac { СК(кг)}{СВ(кг)} *100 = \frac { СК(г)}{СВ(кг)} :10 $$
Показатель следует интерпретировать учитывая, что клетчатка снижает переваримость корма у моногастричных животных (свиньи, собаки), а у жвачных сырая клетчатка обеспечивает нормальное течение пищеварительных процессов в рубце.
В начало

Концентрация обменной энергии (КОЭ).

$$ \frac { ОЭ, \; (МДж)}{СВ \; (кг)} $$
Концентрация обменной энергии (КОЭ) нужно интерпретировать вместе с уровнем кормления и количеством сухого вещества на 100 кг живой массы. Фактически, этот показатель характеризует усвоение рациона. При высокой концентрации рационы усваиваются и перевариваются лучше, животное быстрее отвечает увеличением продуктивности. При низкой наоборот — усвоение и переваримость питательных вещества падают. Однако высокоэнергетические рационы могут привезти к ожирению животного.
В начало

Затраты корма (или концентратов) на единицу продукции.

Показатель рассчитывается для продуктивных животных и служит для экономической оценке эффективности сельхозпроизводства.
Затраты корма на единицу продукции
$$ \frac { ЭКЕ(итого)}{количество \; продукции, \; (кг)} $$
или
$$ \frac { ОЭ (итого)}{количество \; продукции, \; (кг)} :10 $$
Чем меньше затраты корма — тем более экономически выгодно производство продукции. Часто современные программы по расчету рациона производят вычисления как раз исходя их экономической эффективности. Но, низкий показатель не всегда говорит о том, что производство будет рентабельным. Дело в том, что даже при низких затратах при плохой сбалансированности рациона продуктивность будет крайне низкой.
Поэтому на эти показатели нужно ориентироваться как на дополнительные.
так же рассчитывают затраты концентратов на единицу продукции:
$$ \frac {Количество \; кг \; концентрированных \; кормов}{количество \; продукции, \; (кг)} $$
Под продукцией обычно понимают прирост, удой, настриг шерсти и т.д. в килограммах.
В начало

Пример оформления анализа рациона
Структура рациона:
Грубые корма — 48,22%
Сочные корма — 18,78%
Концентрированные корма — 32,99%
Тип кормления: сено-концентратный
Уровень кормления 10.2, при норме: 9,8 (считается только для КРС)
Концентрация обменной энергии в 1 кг сухого вещества: 9,04, при норме: 10,56
Количество сухого вещества на 100 кг живой массы: 3,63, при норме:3,00
Содержание клетчатки в сухом веществе: 23,49, при норме:27,22
Количество переваримого протеина на 1 ЭКЕ: 88,21, при норме:68,42
Кальциево-фосфорное отношение: 1,39, при норме: 1,63
Количество серы на 1 ЭКЕ: 1,54, при норме: 2,74 (считается только для овец)
Примеры оформления анализа рациона можно посмотреть по ссылке

Определение белка по методу Брэдфорда

Список методов Прямое измерение абсорбции поглощение при 280 нм поглощение при 205 нм коэффициент экстинкции Колориметрические анализы установка анализа спектрофотометрия модифицированная Лоури биурет Брэдфорд бицинхониновая Кислота (Смит)

Рекомендации по использованию Тест Брэдфорда очень быстр и использует примерно столько же количество белка по методу Лоури.Это довольно точно и образцы которые находятся вне диапазона, можно повторно проверить в течение нескольких минут. Брэдфорд рекомендуется для общего использования, особенно для определения содержания белка фракций клеток и оценки концентрации белка для гель-электрофореза. Материалы для анализа, включая цветной реагент, стандарт белка, и буклет с инструкциями можно получить в Bio-Rad Corporation. Метод описанное ниже для объема образца 100 мкл с использованием 5 мл красителя. реагент.Он чувствителен к примерно от 5 до 200 мкг белка, в зависимости от от качества красителя. В анализах с использованием 5 мл цветного реагента, приготовленного в лаборатории, диапазон чувствительности — от 5 до 100 мкг белка. Уменьшать объем для «процедуры микроанализа», в котором используется 1 мл кюветы. Описаны протоколы, включая использование планшетов для микротитрования. в листовке, поставляемой с комплектом Bio-Rad. Принцип Анализ основан на наблюдении, что поглощение максимум для кислого раствора кумасси бриллиантового синего G-250 сдвигов от 465 до 595 нм, когда происходит связывание с белком.Оба гидрофобные и ионные взаимодействия стабилизируют анионную форму красителя, вызывая видимое изменение цвета. Анализ полезен, поскольку коэффициент экстинкции раствора комплекса краситель-альбумин постоянна более 10-кратной концентрации спектр. Оборудование В дополнение к стандартным расходным материалам нужен световой спектрофотометр, с максимальным пропусканием в районе 595 нм, на границе видимого спектра (без специальной лампы или фильтр обычно нужен).Стеклянные или полистирольные (дешевые) кюветы могут быть использованный, однако цветной реагент окрашивает оба. Одноразовые кюветы рекомендуемые. Процедура Реактивы Реагент Брэдфорда: растворить 100 мг кумасси бриллиантового синего G-250 в 50 мл 95% этанола добавить 100 мл 85% (мас. / об.) фосфорной кислоты. Разбавить до 1 литра, когда краситель полностью растворится, и профильтровать через Ватман №1 непосредственно перед использованием. (необязательно) 1 M NaOH (используется, если образцы плохо растворяются в цветном реагенте). Реагент Брэдфорда должен быть светло-коричневого цвета. Фильтрация может необходимо повторить, чтобы избавить реагент от синих компонентов. Био-Рад концентрат стоит дорого, но много красителя, очевидно, было проверены на максимальную эффективность. «Самодельные» реактивные работы довольно хорошо, но обычно не так чувствителен, как продукт Bio-Rad. Анализ Прогрейте спектрофотометр перед использованием. При необходимости разбавьте неизвестные вещества, чтобы получить от 5 до 100 мкг. белок как минимум в одной пробирке, содержащей 100 мкл образца При желании добавьте равный объем 1 М NaOH к каждой пробе и вихрь (см. Комментарии ниже). Также добавьте NaOH к стандартам, если это опция используется. Приготовить стандарты, содержащие от 5 до 100 мкг белка (рекомендуется альбумин или гамма-глобулин) в объеме 100 мкл.Узнайте, как настроить анализ, чтобы получить предложения что касается установления стандартов. Добавьте 5 мл красителя и инкубируйте 5 мин. Измерьте оптическую плотность при 595 нм. Анализ Составьте стандартную кривую оптической плотности в зависимости от микрограммов. белка и определите количество по кривой. Определить концентрации оригинальных образцов от количества белка, объема / образца и разведения фактор, если таковой имеется. Комментарии Реагент красителя реагирует в первую очередь с остатками аргинина. и в меньшей степени с гистидином, лизином, тирозином, триптофаном и фенилаланином остатки. Очевидно, что анализ для основных или кислых белков менее точен. Анализ Брэдфорда довольно чувствителен к бычьему сывороточному альбумину, более чем «средние» белки, примерно в два раза. Иммуноглогин G (IgG — гамма-глобулин) является предпочтительным стандартом белка. Дополнение 1 M NaOH был предложен Stoscheck (1990), чтобы позволить солюбилизацию мембранных белков и уменьшить разницу в цвете между белками Уступать. Список литературы Брэдфорд, ММ. Быстрый и чувствительный для количественного определения микрограмм количества белка, использующего принцип связывания белок-краситель. Аналитический Биохимия 72: 248-254. 1976. Stoscheck, CM. Количественное определение белка. Методы в энзимологии 182: 50-69 (1990).

Новый метод определения структуры белка в 20 раз эффективнее

(Физ.org) — Исследования с участием ученых из Тринити-колледжа в Дублине сделали крупный прорыв, который упростит процесс определения структуры белков в клеточных мембранах. Разработка нового метода и специального устройства для реализации наиболее сложной части метода должны иметь большое влияние на исследования, связанные с лекарствами.

Более 50% имеющихся на рынке препаратов белков клеточной мембраны-мишени.Жизненно важно, чтобы исследователи имели трехмерные структуры этих белков клеточной мембраны с высоким разрешением, потому что такие «физиологические дорожные карты» позволяют лучше интерпретировать их функциональные механизмы. Это знание, в свою очередь, может выявить слабые места, которые могут использоваться лекарствами, специально разработанными для действия с высокой избирательностью и эффективностью.

Белки в клеточных мембранах также жизненно важны для повседневного функционирования сложных клеточных процессов. Они действуют как транспортеры, чтобы гарантировать, что определенные молекулы входят в наши клетки и покидают их, как интерпретаторы сигналов, важные для декодирования сообщений и инициирования ответов, а также как агенты, которые ускоряют соответствующие ответы.Поэтому очень важно, чтобы мы знали о них как можно больше.

Основной проблемой, стоящей перед исследователями, является получение больших кристаллов мембранного белка. Эти кристаллы используются для определения трехмерной структуры в сложном процессе, который включает в себя облучение рентгеновскими лучами для создания «дифракционных» картин, которые затем могут использоваться как «уникальные структурные отпечатки пальцев» белков.

Исследовательская группа во главе с профессором структурной и функциональной биологии мембран в Trinity Мартином Кэффри разработала высокопроизводительный метод выращивания кристаллов мембранных белков, в котором используется «липидная кубическая фаза» (LCP).LCP использует среду на жировой основе для выращивания этих кристаллов. Профессору Брайану Кобилка была присуждена Нобелевская премия по химии 2012 года, отчасти за работу, в которой использовалась LCP.

Недавно большие перспективы показал новый метод определения структур мембранных белков, в котором используется безрентгеновский электронный лазер. Однако требовалось огромное количество кристаллов протеина, чтобы получить четкое представление об их структуре, поскольку только 1 из 10 000 пострадал таким образом, чтобы получить пригодные для использования данные. В своем открытии профессор Кэффри в составе большой группы ученых использовал среду LCP на жировой основе, в которой были выращены кристаллы протеина, чтобы направить их через лазер в относительно медленном темпе.Этот более медленный темп привел к значительному увеличению «скорости попаданий», что, в свою очередь, обеспечило более эффективное профилирование структуры белка.

Для того, чтобы новый метод работал, исследователям необходимо было создать устройство для потоковой передачи кристаллов белка клеточной мембраны в среду LCP с постоянной скоростью. Их новое устройство, получившее название «инжектор LCP», напоминает высокотехнологичный шприц, способное регулировать скорость высвобождения LCP по мере необходимости, чтобы минимизировать потери пробы.

Определение структуры белков клеточной мембраны долгое время считалось трудоемкой, трудоемкой и чрезвычайно дорогой необходимостью для медицинских и терапевтических исследований.Но новый метод может изменить это после того, как исследователи показали, что он потребляет в 20 раз меньше белка, чем метод, который обычно использовался ранее.

Ссылаясь на исследование, только что опубликованное в престижном журнале Nature Communications , профессор структурной и функциональной биологии мембран в Trinity Мартин Кэффри сказал: «Эта совместная работа представляет собой огромный прорыв, который должен значительно повысить эффективность с какие исследования проводятся для определения структуры мембранного белка.«

«Инжектор LCP выбрасывает среду LCP с консистенцией, напоминающей зубную пасту, но со скоростью и шириной потока, которые должны строго контролироваться. Достижение этого представляло собой реальную задачу, и очень интересно, что последнее устройство работает так прекрасно. Наша работа будет имеют важные приложения в области исследований лекарственных средств и должны сделать определение структуры интересующих белков гораздо более эффективным и менее затратным ».

---

Новый метод определения структуры белка имеет большое значение для разработки лекарств.

---

Дополнительная информация: Инжектор липидной кубической фазы упрощает серийную фемтосекундную кристаллографию мембранных белков.»Uwe Weierstall, et al. Nature Communications 5, номер статьи: 3309 DOI: 10.1038 / ncomms4309. Получено 28 ноября 2013 г. Принято 24 января 2014 г. Опубликовано 14 февраля 2014 г. Предоставлено Тринити-колледж Дублина

Ссылка : Новый метод определения структуры белка в 20 раз эффективнее (2014, 19 февраля) получено 18 ноября 2020 с https: // физ.org / news / 2014-02-method-protein-effective.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

Методы обнаружения генетически модифицированных культур на основе белков

1.Введение

Население мира быстро увеличивается. Эксперты полагают, что потребности в продуктах питания, вероятно, значительно вырастут в ближайшие 20 лет. Более 800 миллионов человек, включая 33% жителей Африки к югу от Сахары, недоедают. Более 90% из них страдают от длительного недоедания и недостаточности питательных микроэлементов. Генетическая модификация сельскохозяйственных культур может решить эти проблемы. Наследственно измененная форма жизни (ГМО) — это жизнь, геном которой был модифицирован методами технологии рекомбинантной ДНК.Это нововведение изменяет или внедряет по крайней мере одно качество в жизнь посредством генетической модификации. ГМО обладают исключительным потенциалом для повышения урожайности, повышения качества пищевых продуктов, снижения затрат на сырье и повышения творческого потенциала. На сегодняшний день защита от насекомых и устойчивость к гербицидам являются основными бизнес-атрибутами, используемыми при выращивании кукурузы, хлопка и сои [1, 2]. Эти качества дают денежные преимущества агрохимическому бизнесу, рынкам семян и агрономам из-за повышения прибыльности.Кроме того, они, возможно, получают преимущество земли из-за уменьшения использования химикатов или перехода к использованию всех более естественных химикатов.

Развитие ГМ-культур прогрессирует, качество растет, и все большее количество участков земли засевается ГМ-культурами. Прибытие ГМ-урожая и товаров в бизнес-секторы по всему миру увеличило административную потребность в проверке и проверке близости ГМ-культур в урожайности.Мировой регион ГМ-культур расширился с 1,7 миллиона гектаров в 1996 году до 81 миллиона гектаров в 2004 году, причем все больше за счет создания наций. Более 8 миллионов владельцев ранчо получают прибыль от этого нововведения [3]. Около 90% фермеров — мелкие агрономы из развивающихся стран, которые значительно увеличили свои доходы от выращивания биотехнологических культур.

Административная потребность в проверке и подтверждении близости и измерения ГМ-культур возросла с развитием ГМ-культур [4].Эффективный мониторинг ГМ-культур должен осуществляться с помощью улучшения соответствующих методов.

ГМ-культуры можно отличить по трансформированному наследственному материалу на уровне ДНК, последующему белку или фенотипу. Сообщалось о нескольких описательных методах, например, стратегиях с учетом полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации включенной ДНК, иммунологических мерах для обнаружения последующего белка или использовании биологических анализов для распознавания результирующего фенотипа.Вестерн-блоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и палочки с параллельным потоком являются распространенными методами тестирования на основе белков [5]. Появляется несколько других диагностических достижений, которые могут дать ответы на текущие специализированные вопросы тестовых экзаменов GM. Эти методы включают масс-спектрометрию, хроматографию, ближнюю инфракрасную спектроскопию, миниатюрные производимые устройства и, в частности, инновации в ДНК-чипах (микроматрицы) и в основном иммуноанализы. Для определения генетически модифицированных белков используются различные иммуноанализы.

Тест на образце — это, по большей части, отборочный тест, который может определить объем ГМО. Это можно отследить с помощью определенного теста для распознавания типа ГМО в образце и дополнительно предназначенного для измерения количества конкретного ГМО. Львиная доля стратегий распознавания белков зависит от иммуноанализов для обнаружения и оценки новых (внешних) белков, представленных в результате генетической модификации растений. Иммуноанализ зависит от реакции между антигеном и противодействующим агентом.Стратегии обнаружения белков при тестировании на ГМО переходят от умеренных и простых в исполнении к более совершенным методам, требующим дорогостоящего оборудования. Стратегии обнаружения белков могут использоваться для распознавания ГМ-атрибутов в ГМ-культурах [6]. Тестирование на ГМО превратилось в жизненно важный и важный элемент производства продуктов питания для обеспечения соблюдения правил маркировки, подтверждения структуры интеллектуальной собственности и защиты клиентов путем утверждения заявлений о том, что «не содержат ГМО» [7].

Анализы связывания широко используются в лабораториях для обнаружения и количественного определения белков в образцах.Анализы биологических образцов, таких как моча, цельная кровь, плазма, сыворотка и другие биологические жидкости, часто проводят в больницах и клинических лабораториях. Эти анализы связывания также могут быть выполнены в естественных, садоводческих, ветеринарных, механических, спортивных, законных / криминологических условиях и, кроме того, мгновенно обнаруживая непреодолимые болезни при серологическом тестировании людей и животных. Принципы, используемые в таких анализах, хорошо известны специалистам в данной области. Многие такие устройства описаны и доступны в продаже.Иммунологический анализ связывания — это сэндвич-анализ. Однако в клинических лабораториях использование устройств для твердофазного хроматографического анализа связывания стало обычным явлением из-за их относительной простоты использования, экономичности и воспроизводимости. Обычно эти устройства для хроматографического анализа состоят из пористой хроматографической среды, которая действует как матрица для анализа связывания. Образец добавляется прямо или косвенно к одному концу среды и хроматографически транспортируется к детектирующему реагенту, с которым он вступает в реакцию с образованием меченого продукта, который затем транспортируется в зону тестирования, содержащую иммобилизованный захватывающий реагент, такой как захватывающее антитело. в котором можно определить наличие, отсутствие или количество аналита.

Это зависит от иммунохроматографии и измерений бокового потока. Он идентифицирует с помощью тест-полосок для иммуноизмерительных приборов и особенно тех тестовых устройств, которые используются для проведения иммунологических и серологических ограничивающих тестов. Этот новый стрип-тест недорогой, быстрый, удобный и менее трудоемкий. Его можно использовать для качественного или полуколичественного определения наличия представляющих интерес образцов белка. Технологии использования таких щупов для обнаружения ГМО постоянно развиваются.

ГМО обладают огромным потенциалом для увеличения урожайности, улучшения качества питательных веществ, снижения затрат и повышения творческих способностей. На сегодняшний день устойчивость к насекомым и гербицидам является основным бизнес-атрибутом кукурузы, хлопка и сои. Мировые площади под ГМ-культурами увеличились в 47 раз, с 1,7 миллиона гектаров в 1996 году до 81 миллиона гектаров в 2004 году, причем эти площади развивались в развивающихся странах [2, 3]. Тестирование на ГМО превратилось в незаменимую и важную часть производства пищевых продуктов, обеспечивающую соблюдение правил маркировки.Белковые методы, например, ELISA и стрип-тесты, пригодны для натуральных продуктов, но зависят от доступности бизнес-единиц и не подходят для готовых продуктов из-за деградации белка [7]. Системы параллельных потоков бывают субъективными или полуколичественными [4]. Иммуноанализы могут применяться в широком масштабе для распознавания новых белков в сырых пищевых продуктах. Достижения иммуноанализа идеально подходят для субъективного и количественного обнаружения многих видов белков и патогенов в сложных системах [5, 8].Эффективное тестирование ГМ-продуктов должно осуществляться с помощью улучшения правильных стратегий обнаружения. Эти стратегии по большей части предназначены для изучения новых белков или ДНК.

Для утверждения научной стратегии необходимо охарактеризовать цель тестирования и продемонстрировать качество исполнения. Качество исполнения включает в себя точность, мастерство извлечения, точность, воспроизводимость, обрабатываемость, специфичность и прочность. Использование утвержденных стратегий необходимо для гарантии признания результатов, полученных диагностическими исследовательскими учреждениями [9].Большая часть методов обнаружения белков зависит от иммуноанализа. Методы обнаружения белков могут, возможно, распознать близость конкретного качества ГМ и дать общее измерение уровня экспрессии трансгена. Стратегии идентификации белков чрезвычайно разумны для проверки конкретных ГМ-атрибутов при обработке сырых продуктов, при условии, что белок передается в исследуемой части растения.

Вот подробности иммуноанализов, используемых для обнаружения генетически модифицированных белков.

2. Иммуноанализ

Иммуноанализ — это биологический тест, который идентифицирует и количественно определяет микро- или макромолекулы с помощью антигена или антитела, при этом определяемая молекула называется аналитом. Специфические антигены могут стимулироваться специфическими иммунными ответами, и в результате иммунного ответа в организме вырабатываются антитела, которые являются белками, и у них есть смысл обнаруживать присутствие любого чужеродного антигена в организме. Иммуноанализы различаются по форматам. Эти анализы включают несколько этапов, на которых добавляются реагенты, а затем смываются дополнительные реагенты.Многоступенчатые анализы часто называют гетерогенными иммуноанализами или разделяющими иммуноанализами [10]. Несколько иммуноанализов могут быть выполнены путем смешивания образцов и реагентов, и они являются иммуноанализами без разделения или гомогенными иммуноанализами. Жизненно важным компонентом иммуноанализа является антитело, которое имеет высокую специфичность в отношении целевой молекулы (антигена), а область антигена, к которой прикрепляется антитело, называется эпитопом. Стандарты или калибраторы известной концентрации используются для количественного определения неизвестной концентрации аналита.Эти определения антигена или антитела происходят с помощью меток, прикрепленных к антигену или антителу. Многие метки можно обнаружить, поскольку они вызывают изменение цвета раствора, испускают излучение или могут быть индуцированы излучением света или флуоресценции в УФ-свете. Наиболее часто используемые метки для иммуноанализа — это ферменты.

2.1. История

В 1950-х годах первый иммуноферментный анализ был разработан Соломоном Берсоном Розалин Сассман Ялоу. В 1977 г. Ялоу получила Нобелевскую премию за свою работу и вошла в список вторых американских женщин, получивших эту награду [11, 12].В 1960-х годах [13] иммуноанализ стал более простым с открытием химически связанных ферментов с антителами, а позже, в 1983 году [14], профессор Энтони Кэмпбелл из Кардиффского университета представил эфир акридиния в иммуноанализе, который использовал собственный свет. Этот иммуноферментный анализ помог количественно определить широкий спектр патогенов, белков и других белков в образцах крови [14].

3. Классификация иммуноанализов

1. Конкурентные гомогенные иммуноанализы

2. Конкурентные гетерогенные иммуноанализы

3. Односайтовые неконкурентные иммуноанализы

4. Двухсайтовые неконкурентные

149 .1. Конкурентные гомогенные иммуноанализы

В конкурентных гомогенных иммуноанализах существует конкуренция между меченым и связанным аналитом (связанным с антителом) с немеченым и несвязанным аналитом в образце. В качестве конкуренции немеченый и несвязанный аналит вытесняет меченый и связанный аналит и прикрепляет их к месту, в то время как отделенный меченый аналит затем дает флуоресценцию, и эта флуоресценция измеряется, которая пропорциональна количеству немеченого и исходного несвязанного аналита в пример.

3.2. Конкурентный гетерогенный иммуноанализ

В гетерогенном анализе существует конкуренция между связанным и меченным аналитом (связанным с антителом) с несвязанным и немеченым аналитом, отличие от конкурентного гомогенного анализа состоит в том, что меченый несвязанный / вытесненный аналит отделяется промыванием и оставшийся меченый и связанный аналит измеряется.

3.3. Односайтовый неконкурентный иммуноанализ

В этом иммуноанализе количество неизвестного аналита в образце измеряется путем добавления меченых антител.Меченые антитела присоединяются к аналиту в образце, а лишние меченые несвязанные антитела вымываются, поэтому в образце присутствуют только меченые и связанные антитела, измеряется интенсивность флуоресценции этих антител, которая пропорциональна 3.4. количество неизвестного аналита в образце.

3.4. Двухсайтовые неконкурентные иммуноанализы

В этом иммуноанализе антитело присутствует на сайте, и аналит в образце добавляется к прикрепляемому антителу, а затем добавляется второе антитело, которое прикрепляется с помощью метки.Если в растворе нет определенного аналита, второе антитело не прикрепится. Затем измеряется флуоресценция меченого антитела, которая прямо пропорциональна количеству аналита в образце. Очень важно учитывать, что после каждой реакции есть этапы промывки, поэтому лишние материалы всегда смываются. Другой очень важный момент — это то, какие метки прикреплены и как измеряется флуоресценция / сигнал. Подробная информация на этикетках приведена ниже:

3.4.1. Радиоактивные изотопы

Для проведения радиоиммуноанализа (РИА) в реагенты для иммуноанализа могут быть добавлены радиоактивные изотопы, а излучение, испускаемое связанным комплексом антиген-антитело, может быть определено обычными методами. РИА считается одним из первых разработанных иммуноанализов, и в настоящее время они не используются часто из-за опасности радиоактивности [16, 17].

3.4.2. Флуорогенные репортеры

Многие современные иммуноанализы проводятся с использованием флуорогенных репортеров, и белковые микроматрицы являются лучшим примером использования этих меток [18, 19].

3.4.3. Электрохемилюминесцентные метки

Электрохимические метки — это метки, которые излучают свет в ответ на электрический ток, при этом обнаруживается хемилюминесценция [20].

3.4.4. ДНК-репортеры

В количественной ПЦР в реальном времени добавляются традиционные методы иммуноанализа, и это называется иммуно-количественной ПЦР в реальном времени (iqPCR). Метки, используемые в этом анализе, представляют собой ДНК-меченные зонды [21, 22].

3.4.5. Ферменты

Наиболее часто используемые метки в иммуноанализах — это ферменты, такие иммуноанализы называются иммуноферментными анализами (ИФА) или иногда иммуноферментными анализами (ИФА).В таких анализах используются различные ферменты, например глюкозооксидаза, пероксидаза хрена (HRM) и щелочная фосфатаза. Ферменты подвергаются воздействию реагентов, которые вызывают у них хемилюминесценцию или свет.

4. Иммуноанализы без меток

Есть несколько иммуноанализов, в которых метки не требуются, например, в одном иммуноанализе антигены измеряются по изменению сопротивления электрода по мере того, как антиген прикрепляется к нему. В другом методе связывание между немеченым антителом и антигеном обнаруживается резонансом, и этот метод называется поверхностным плазмонным резонансом, и эти резонансные сигналы производятся метками металлических наночастиц, которые можно измерить с помощью микрофона [23, 24].

Различные методы, в которых используются иммуноанализы, включают следующие:

1. Радиоиммуноанализ

2. ELISA

3. Анализ иммуностимуляции лимфоцитов памяти (MELISA)

4. Иммуноскрининговый анализ

   EDIA )

5. Тест бокового потока

6. Магнитный иммуноанализ (MIA)

7. Объемный иммуноферментный анализ (SOFIA)

8. Ультрачувствительное определение антител с помощью ПЦР агглютинации

9. CD / DVD-based иммуноанализ.

4.1. Радиоиммуноанализ

RIA — это обширный метод, в котором радиоактивные метки используются поэтапно, поскольку это очень специфический и чувствительный метод, требующий специального оборудования. Другой такой метод называется иммунорадиометрическим анализом (IRMA), в котором радиоактивные метки используются немедленно, а не поэтапно. Радиоаллергосорбентная проба (РАСТ) используется для определения аллергена при аллергии. Это самый дешевый метод иммуноанализа. Хотя это самый дешевый метод проведения иммуноанализа, он требует специального лицензирования и мер предосторожности, поскольку используются радиоактивные соединения [25, 26, 27, 28].

4.1.1. Метод

Для проведения радиоиммуноанализа требуются следующие шаги:

1. Гамма-радиоактивные изотопы йода, например 125-I, присоединенные к тирозину, используются для метки известного количества антигена

2. Известное количество антитела смешивают с этими радиоактивно меченными антигенами.

3. Меченый антиген и немеченое антитело прикрепляются своими сайтами связывания.

4. К смеси добавляют образец сыворотки, содержащий тот же антиген неизвестного количества.

5. Конкуренция между меченым («горячим») и немеченым («холодным») антигеном строится для связывания с сайтами связывания антител.

6. Когда концентрация неизвестного антигена увеличивается, он начинает вытеснять меченый антиген из участков связывания антитела

7. Вытесненные меченые антигены и связанные комплексы антиген-антитело разделились, и радиоактивность вытесненных радиоактивно меченых антигенов снизилась. измеряется гамма-счетчиком.

* Радиоиммуноанализ может быть выполнен так же, как и метод сэндвич-ELISA (см. Сэндвич-ELISA), разница в том, что в ELISA фермент связан с вторичным антителом, а в этом сэндвич-радиоиммуноанализе используется радиоактивное соединение.

4.2. Иммуноферментный анализ (ELISA)

ELISA — это тип иммуноанализа, и принцип его работы такой же, как и у иммуноанализа, только это тест на основе влажной лаборатории, в котором используется твердофазный фермент, поэтому также называется иммуноферментным анализом (ИФА). ELISA считается тестом контроля качества в промышленности и диагностическим тестом в больницах. ELISA подпадает под категорию анализов связывания лиганда, поскольку он включает в себя связывание антитела и антигена.Когда меченые антигены или антитела прикрепляются к субстратам, они вступают в реакцию, вызывающую изменение цвета, и этот цвет используется в качестве сигнала. Этот субстрат для связывания ферментов был разработан Stratis Avrameas и G.B. Пирс. Поскольку после каждой реакции очень необходимо смывать ненужные или несвязанные химические вещества, поэтому связанный комплекс антиген-антитело должен быть закреплен на поверхности контейнера с помощью иммуносорбента, и этот метод был разработан Джеркером Поратом. и Wide в 1966 году.В 1971 году группа ученых Бауке ван Веемен и Антон Шуурс из Нидерландов, а также Ева Энгвалл и Петер Перлманн из Швеции независимо друг от друга опубликовали статьи, описывающие методы ELISA / EIA. Обычно используются хромогенные репортеры и субстраты, которые дают наблюдаемое изменение цвета в зависимости от количества комплекса антиген-антитело. В ELISA твердая фаза, которая физически иммобилизована, используется для абсорбции определенных компонентов жидкой фазы, в которой содержится определяемое аналит.Добавляются, инкубируются и смываются различные реагенты и растворы, и, в конце концов, происходят некоторые оптические изменения, которые измеряются спектрофотометром на определенной длине волны. Если антиген присутствует в жидкости, подлежащей диагностике / обнаружению, то добавляется меченое антитело и наоборот, а затем добавляется субстрат, который реагирует с ферментом меченого антигена или антитела, а затем добавляется стоп-раствор, чтобы остановить реакции, и изменение цвета измеряется при определенных длинах волн с помощью ридера ELISA.ELISA может давать результаты в двух формах [12, 29, 30, 31]:

1. Качественный: в количественном ELISA можно указать только положительные или отрицательные результаты. Пороговое значение регулируется путем анализа известных положительных и отрицательных образцов, а оптическая плотность раствора измеряется спектрофотометром.

2. Количественный: Количественный ИФА используется для количественной оценки аналита, используются серии стандартов и измеряется неизвестное количество аналита.

На рынке также доступны различные наборы для каждого типа ELISA в соответствии с приложением и требованиями. В основном, основной принцип и методология одинаковы. Процедуры и реагенты поставляются с каждым конкретным набором вместе с методологией.

Ниже приведены четыре различных типа ELISA и их методологии:

4.2.1. Прямой ИФА

Прямой ИФА, состоящий из следующих этапов:

• Жидкий раствор, содержащий определяемое вещество, добавляется в микротитровальный планшет, по одному образцу на лунку планшета.Пластина имеет твердую / пластичную фазу, которая поглощает аналит путем перезарядки.

• Белки бычьей сыворотки или казеин добавляют в лунки, которые не реагируют, чтобы покрыть ту часть пластика, которая не покрыта антигеном.

• Добавляется первичное антитело с присоединенным ферментом, и оно связывается с антигеном.

• Добавляется субстрат, который изменяет цвет раствора за счет реакции с ферментами.

• Чем выше концентрация первичного антитела в растворе, тем сильнее будет изменение цвета и выше будет анализируемое вещество в анализируемой жидкости.

• Основным недостатком прямого ELISA является то, что, когда антиген должен быть измерен в сыворотке, мобилизация антигена становится затруднительной из-за многих других белков, присутствующих в сыворотке. В этом случае более подходящим становится сэндвич-метод или непрямой ИФА (рис. 1).

Рисунок 1.

Прямой ИФА. На этом рисунке показан прямой ELISA, в котором определяемый аналит (антиген) присоединяется к меченому антителу, а затем добавляется хромогенный субстрат, который реагирует с ферментом и дает флуоресценцию.

4.2.2. Сэндвич-ИФА

Сэндвич-ИФА — это тип иммуносорбентного анализа, в котором один антиген помещен между двумя антителами или одно антитело находится между двумя антигенами для более специфических реакций. Процедура ELISA приведена ниже [32, 33]:

1. Известное количество антитела связано с фиксированной поверхностью.

2. Неспецифические участки на твердой поверхности блокируются бычьим сывороточным альбумином, казеином или любым другим подобным нейтральным раствором.

3. Образец, содержащий антиген, наносится на планшет и захватывается антителом.

4. Несвязанные антигены вымываются промывным раствором.

5. Добавляется вторичное антитело, которое также мечено ферментами.

6. Несвязанные антитела вымываются.

7. Сэндвич состоит из двух антител и одного антигена внутри.

8. Добавляется субстрат, и фермент вступает в реакцию с субстратом и дает цвет, пропорциональный количеству антигена.

9. Поглощение, флуоресценция или электрохимический сигнал (например, ток) образцов измеряется для определения наличия антигена и его количественной оценки (рисунок 2).

Рисунок 2.

Сэндвич-ELISA. На этом рисунке показано, что антиген — это аналит, который находится между двумя антителами, антитело может быть зажато между двумя антигенами таким же образом.

4.2.3. Непрямой ИФА

Непрямой ИФА аналогичен прямому ИФА, только первичное антитело было немечено, которое очень специфично к антигену, и добавлено меченое вторичное антитело, которое помечено ферментом или любой другой меткой (рис. ).

Рисунок 3.

Непрямой ИФА. На этом рисунке показано, что антиген является определяемым аналитом, добавляется первичное антитело, специфичное к антигену, затем добавляется вторичное антитело, которое маркируется ферментом, а после этого добавляется хромогенный субстрат, который реагирует с ферментом и дает флуоресценцию. .

4.2.4. Конкурентный ELISA

В этом ELISA есть конкуренция аналита. Процедура следующая:

1. Первый образец, содержащий антиген, инкубируют в присутствии антитела.

2. Затем этот комплекс антиген-антитело добавляют в лунку, покрытую антигеном.

3. Планшет промывают, чтобы удалить все несвязанные антитела, и комплекс антиген-антитело (Ag-Ab) конкурирует с меченым антигеном, так как несвязанных антител меньше, а покрытый антиген должен связываться с антителами, которые будут взяты. от связанного комплекса Ag-Ab.

4. Затем добавляется вторичное антитело, которое связывается с ферментом.

5. Добавляется субстрат, и в результате реакции фермента и субстрата образуется цвет.

6. Чтобы предотвратить возможное насыщение сигнала, добавляется стоп-раствор, чтобы остановить реакцию.

В некоторых наборах вместо антител используются ферментно-связанные антигены, а оставшийся механизм конкуренции такой же, как описано ранее; следовательно, будет конкуренция антигенов вместо антител.

4.2.5.Применение ELISA

Для определения иммунного ответа в организме используется иммуноферментный анализ (ELISA), который имеет разные методы. Эти методы широко используются для определения анализируемого вещества в биологических образцах цельной крови, сыворотки, мочи и других биологических жидкостей. Эти анализы находят широкое применение в сельском хозяйстве, промышленности, окружающей среде, спорте, а также в юридической / судебной медицине [34, 35, 36, 37, 38].

Этот анализ можно использовать для определения:

1. Антиген, присутствующий в онкологических образцах.Повышенные уровни карциноэмбрионального антигена (CEA) и простатоспецифического антигена (PSA) могут быть использованы для ранней диагностики онкогенных процессов.

2. С помощью иммуноанализа можно диагностировать другие расстройства и заболевания, например, антигенные детерминанты возбудителей инфекционных заболеваний, включая грибы, вирусы, бактерии и дрожжи. Helicobacter pylori , Mycobacterium tuberculosis, малярия, вирус Западного Нила, ВИЧ, вирус папилломы человека (ВПЧ), хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) при беременности, определение гормонов, определение желудочно-кишечных расстройств, определение наследственных метаболических заболеваний ферментами, гексозаминидаза в качестве маркера болезни Тея-Сакса и гистидазы как маркера гистидинемии, определение повреждения тканей тканеспецифическим антигеном в циркуляции путем определения креатининкиназы для повреждения мышц сердечного тропонина при инфаркте миокарда.

3. Подходящая идентификация чужеродного белка в генетически модифицированных организмах (ГМО) и антителах.

4. Для тестирования образцов крови спортсменов на рекомбинантный гормон роста в спортивных антидопинговых лабораториях широко используются иммуноанализы (rGH, rhGH, GH, hGH).

4.3. Анализ иммуностимуляции лимфоцитов памяти (MELISA)

Гиперчувствительность IV типа к химическим веществам, металлам и токсинам окружающей среды, таким как плесень, может быть определена с помощью иммуноанализа, который называется иммуностимуляцией лимфоцитов памяти (MELISA).Тест определяет вредное вещество в крови, которое вызывает аллергические реакции, но не измеряет количество токсичных веществ. Две исследовательские статьи показали, что MELISA дает много ложноположительных результатов, а одно последующее исследование показало, что это очень надежный, специфический и чувствительный метод обнаружения металлов у пациентов с аллергией на металлы [39, 40, 41, 42, 43].

4.4. Иммуноскрининг

Это метод определения белков, продуцируемых генами, вставленными в векторы экспрессии.Для этого должна быть доступна антисыворотка, а вторичные антитела также должны быть помечены радиоактивными соединениями или ферментами [44].

4.5. Иммуноанализ клонированного донора фермента

В этом типе иммуноанализа, в котором используются два типа ферментов, которые могут быть активными только тогда, когда они объединяются вместе [45]. Один фермент конъюгирован с определенным анализируемым веществом того же типа, и этот ферментный комплекс называется конъюгатом анализируемое вещество-фермент-фрагмент. Другой фермент прикрепляется к специфическому антителу.Конъюгат анализируемого вещества-фермента-фрагмента не может собираться с другим ферментом, если он присоединен к антителу. Для этого нужно вытеснить антитело из фермента.

Следовательно, когда определяемый аналит, присутствующий в сыворотке, смешивают с конъюгатом анализируемое вещество-фермент-фрагмент и антитело-фермент. Существует конкуренция между аналитом в сыворотке и конъюгатом анализируемое вещество-фермент-фрагмент. Если концентрация анализируемого вещества в сыворотке высока, тогда он будет связываться с антителом-ферментом, и фермент будет свободно связываться с конъюгатом анализируемое вещество-фермент-фрагмент, чтобы придать ферментативную активность с субстратом.Это означает, что чем выше концентрация аналита в сыворотке, тем выше будет активность фермента, и наоборот.

4.6. Иммунохроматографические анализы с боковым потоком

Простые устройства (полоски) используются для обнаружения интересующего аналита в образце без необходимости в каком-либо оборудовании. Среди таких тестов широко используются домашний тест на беременность, тест на ВГС, диагностический тест на ВГВ и так далее. Иммуноанализы могут широко применяться в промышленных масштабах для распознавания белков в пище [10, 46, 47, 48, 49].Тест используется для обнаружения культур Bt-GM на экспрессию инсектицидного кристаллического белка (ICP) Bacillus thuringiensis . Одношаговые тесты с боковым потоком, которые также называют иммунохроматографическими полосками (ICS) или тестами с помощью щупов, были популярной платформой для качественных быстрых визуальных тестов, в которых для генерации сигналов используется конъюгат коллоидного золота.

В предыдущих методиках устройства для тестирования бокового потока QuickStix используют те же принципы иммуноанализа, что и формат планшета, но наносят антитела и другие реагенты на нитроцеллюлозную мембрану, а не на внутреннюю часть лунок или пробирок.Мембраны из нитроцеллюлозы (NC) были первым выбором производителей устройств на протяжении более 20 лет. Устройство для анализа тест-полосок, в котором мобильный конъюгат, помеченный коллоидными метками, такими как золото, может быть нанесен на хроматографическую среду и после реакции с аналитом, таким образом, транспортирован с растворителем в тестовую зону. Меченый подвижный реагент для обнаружения вступает в реакцию с аналитом, и полученный продукт мигрирует с жидким образцом по мере продвижения образца в зону тестирования. Во время производства, после того как немеченый связывающий агент добавлен и иммобилизован в тестовой зоне, оставшаяся часть материала тест-полоски обрабатывается блокирующими агентами, чтобы заблокировать любые оставшиеся сайты связывания.Зона, где расположен подвижный меченый реагент, часто называется «зоной мечения», но может называться «зоной обратимой иммобилизации» или «зоной мобилизации», в то время как аналит реагирует с мобилизованным меченым реагентом, жидкостью Образец и мобилизованный меченый реагент перемещается дальше внутри пористого носителя в зону обнаружения, где реагент, связывающий тот же аналит, фиксируется или иммобилизуется, обычно в виде линии. Важные аспекты пар антител включают стерическое разделение эпитопов, адекватный титр исходных материалов, высокую аффинность, высокую специфичность, высокую авидность и чистоту.

Преимущества иммунохроматографических тестов включают удобный формат, очень короткое время для получения результата теста, долгосрочную стабильность в широком диапазоне климатических условий и относительно дешевую стоимость изготовления. Эти особенности делают полосковые тесты идеальными для таких приложений, как домашнее тестирование, экспресс-тестирование в местах оказания медицинской помощи и тестирование в полевых условиях для различных экологических и сельскохозяйственных аналитов. Он ограничен только приложениями диагностического скрининга. Более того, достижимая чувствительность примерно в 10–100 раз хуже, чем у инструментального лабораторного иммуноанализа, что ограничивает применимость технологии только аналитами с относительно высоким содержанием.Некоторые из наиболее распространенных тестов с боковым потоком, представленных в настоящее время на рынке, предназначены для выявления беременности, стрептококковой ангины [50], хламидиоза и бруцеллеза человека [51]. Анализы бокового кровотока широко используются в качестве диагностических инструментов для мониторинга токсинов (рис. 4).

Рисунок 4.

Метод бокового потока.

4.7. Магнитный иммуноферментный анализ (MIA)

Магнитные наночастицы были открыты французом Луи Нилом, и он получил первую Нобелевскую премию по физике в 1970 году. Ученые описали суперпарамагнитные свойства этих магнитных наночастиц в магнитном поле.Эти составляющие магнитные наночастицы находятся в диапазоне 5–50 нм, в то время как магнитные шарики могут находиться в диапазоне 35–4,5 мкм. Был разработан новый тип диагностического иммуноанализа с использованием этих магнитных шариков в качестве меток. Наличие магнитных меток измеряется магнитным считывателем, то есть магнитометром. Следовательно, сигналы, измеряемые прибором, прямо пропорциональны аналиту в сыворотке (токсину, сердечному маркеру, вирусу, бактериям). Суперпарамагнитное качество этих шариков уже применялось на практике при магнитно-резонансной томографии (МРТ) [52].

4.8. Объемный иммуноанализ оптического волокна (SOFIA)

В миллиард раз более чувствительный и динамичный метод, чем традиционные методы диагностики, — это «объемный иммуноанализ оптического волокна (SOFIA)» для диагностики in vitro, в котором для регистрации флуоресценции используется сборка объемного оптического волокна. из образца. Чувствительность SOFIA до уровня аттограмм, то есть (10 ⁻¹⁸ г). SOFIA может различать аналит на 10 порядков. Этот метод используется для скринингового теста ante mortem на скрейпи, BSE, vCJD, CWD, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и трансмиссивные губчатые энцефалопатии [53].

4.9. Обнаружение сверхчувствительных антител с помощью агглютинации-ПЦР (ADAP)

С помощью этого метода антитела в сверхчувствительном растворе обнаруживаются синтетическими конъюгатами антиген-ДНК, которые позволяют лигировать цепи ДНК, а количественное определение проводится с помощью кПЦР. ADAP может обнаруживать зепто-аттомоли антител с динамическим диапазоном 5–6 порядков величины в 2 мкл образца. ПЦР с агглютинацией дает в 1000 раз более чувствительные результаты при определении аутоантител к тиреоглобулину в плазме крови пациента.ADAP очень чувствителен, используется очень дешевое оборудование, такое как Slip Chip, и нет необходимости использовать опасные радиоактивные соединения [54].

4.10. Иммуноанализ на основе CD / DVD

Хранение и поиск информации могут выполняться на металлическом отражающем слое и на поверхности поликарбоната CD / DVD. Металлическая поверхность компакт-диска иногда изготавливается из чистого золота, и оно демонстрирует отличную оптическую активность, и этот металл может выполнять роль подложки, и соединения могут присоединяться к ней, и в результате он может изменять преломляющие и отражающие свойства диск, и полученные сигналы могут определить количество аналита в образце.

В дополнение к вышеупомянутым иммуноанализам существует множество других иммуноанализов на основе ELISA, разница в том, что ELISA используется для определения аналита в жидком растворе, в то время как эти методы используются для определения аналита в образцах тканей после выполнения серии шагов, обеспечивающих легкое время анализа, например, вестерн-блоттинг, иммуногистохимия, дот-блоттинг, иммуноцитометрия, иммуноокрашивание. Очень важно знать, что в иммуноанализах большое значение имеют антитела иммуноглобулина, но ученые прилагают все усилия, чтобы сделать эту процедуру более дешевой.

5. Аптамеры

Аптамеры представляют собой одноцепочечные олигонуклеотиды молекул ДНК или РНК и обладают свойством связываться с высокой аффинностью и специфичностью со своей мишенью из-за их сильного взаимодействия и наноразмеров соответственно. Это свойство аптамеров может быть использовано для ряда приложений в биомедицинских исследованиях, их высокая эффективность молекулярного распознавания делает их эффективными биосенсорами и, следовательно, их можно использовать для разработки тестов против различных мишеней [55]. Различные аптамеры могут быть синтезированы для конкретной мишени с помощью процесса, называемого систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX).Биосенсорные свойства аптамеров обеспечивают быстрое и легкое обнаружение целевых молекул. Это свойство может быть использовано для диагностики и других биомедицинских приложений, которые помогут бороться с рядом заболеваний, включая СПИД, рак, болезнь Альцгеймера, вирусные и бактериальные инфекции. Ряд аптамеров можно идентифицировать против различных мишеней, включая нуклеотиды, белки, липиды, сигнальные молекулы и даже целые клетки и микроорганизмы. Последние достижения в исследованиях доказали, что аптамеры РНК имеют высокую терапевтическую и диагностическую ценность.Его также можно использовать для терапевтической доставки олигонуклеотидов. Все эти атрибуты аптамеров делают их ключевыми инструментами появляющейся бионанотехнологии и биосенсоров. Некоторые исследовательские группы работают над технологией аптамеров и используют их в качестве аптасенсоров, но это требует большего внимания, чтобы активизировать наши исследования для диагностики и борьбы с различными заболеваниями. Аптамеры легко синтезировать и более стабильны по сравнению с антителами; следовательно, они могут быть полезны в наших будущих достижениях в области терапии и диагностики [56].

Трехмерная структура белков. Краткое содержание –Существует 4 уровня структуры белка –Методы определения структуры белка –Вторичная структура белков.

Презентация на тему: «Трехмерная структура белков. Краткое содержание –Существует 4 уровня структуры белка –Методы определения структуры белка –Вторичная структура белков». — Стенограмма презентации:

1 3-D структура белков

2 Схема — Существует 4 уровня структуры белка — Методы определения структуры белка — Вторичная структура белков Структура a-спирали b Другие конформации обнаружены в глобулярных белках — Третичная структура глобулярных белков — Четвертичная структура — Сворачивание и стабильность белка — Сворачивание белка с помощью шаперонов — денатурация и ренатурация белков — коллаген, волокнистый белок — миоглобин, глобулярный белок — гемоглобин, глобулярный белок, обладающий четвертичной структурой — связывание кислорода с миоглобином и гемоглобином — кривые связывания кислорода миоглобина и гемоглобина

3 Белки — главные действующие лица в жизни клетки.Каждый белок представляет собой уникальную последовательность аминокислотных остатков, каждый из которых складывается в уникальную стабильную трехмерную структуру, которая является биологически функциональной. Белки представляют собой наиболее разнообразную в структурном и функциональном отношении группу макромолекул. Их переменные функции проистекают из некоторых ключевых особенностей: 1. Белки — это линейные полимеры, построенные из строительных блоков, называемых аминокислотами. –Неограниченный порядок аминокислот делает неограниченное разнообразие белков. — алфавиту основных аминокислот в белках несколько миллиардов лет.–Каждый белок представляет собой уникальную последовательность аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. пептидные связи очень стабильны (в отсутствие фермента пептидная связь может длиться 1000 лет) 2. Белки содержат широкий спектр функциональных групп. –Гидроксиды, тиолы, тиоэфирные кислоты, карбоновые кислоты, аминогруппы, фосфаты и т.д… –реактивность этих групп определяет активность ферментов. 3. Белки могут взаимодействовать друг с другом и с другими биологическими молекулами, образуя сложные сборки. Молекулярное сотрудничество приводит к молекулярному синергизму (белки в группе действуют синергетически, генерируя возможности, недоступные отдельным компонентам белков).

4 Конформация = пространственное расположение атомов, зависящее от вращения связей. Может меняться без разрыва ковалентных связей. Поскольку каждый остаток имеет ряд возможных конформаций, а в белке много остатков, количество возможных конформаций для белка огромно. Нативная конформация = единственная стабильная форма, которую белок принимает в физиологических условиях.

5 В нативной конформации вращение вокруг ковалентных связей в полипептиде ограничивается рядом факторов (Н-связывание, слабые взаимодействия, стерическое вмешательство). Биологическая функция белков полностью зависит от его конформации.В биологии форма — это все. Белки можно разделить на шаровидные и волокнистые. Некоторые белки довольно жесткие, в то время как другие демонстрируют ограниченную гибкость. Жесткие белки часто являются структурными белками. Гибкость полезна для создания петель, пружин и рычагов.

6 Существует 4 уровня структуры белка. Первичная структура — линейная последовательность аминокислот — определяется нуклеотидной последовательностью гена — удерживается ковалентными силами — первичная структура определяет общую форму свернутых полипептидов (т.е.Первичная структура определяет вторичные, третичные и четвертичные структуры). Вторичная структура — участки регулярно повторяющихся конформаций пептидной цепи (a-спирали, b-листы) — поддерживаются Н-связями между амидными атомами водорода и карбонильными атомами кислорода пептидного остова. Третичная структура — полностью свернутая и уплотненная полипептидная цепь. –Стабилизируется взаимодействием боковых цепей несоседних аминокислотных остатков (волокнистые белки не имеют третичной структуры). Четвертичная структура –ассоциация двух или более полипептидных цепей в мультисубъединичный белок.

8 Взаимодействия в Folding Protein с самим собой: Водородные связи Электростатические взаимодействия Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия Белок-растворитель: вызывает захоронение гидрофобных остатков Гидрофобный остаток Гидрофильный остаток Гидрофобное ядро

9 Вторичная структура белков. Вторичная структура — это водородная структура остова белка.Двумя наиболее распространенными вторичными структурами являются a-спираль и b-нити (многие нити образуют листы). Наиболее часто наблюдаемая вторичная структура a-Helix.

10 Практически всегда, как правосторонние, обычно имеют 3,5-3,7 остатка на оборот: шаг (продвижение на оборот) = увеличение 0,54 нм (продвижение на аминокислотный остаток) = 0,15 нм каждый карбонильный кислород (остаток n) полипептидной основной цепи, Н-связанной с основной амид водорода четвертого остатка по направлению к С-концу (n + 4).Следовательно, первые 3 и последние 3 остатка не имеют партнеров по водородной связи внутри спирали) каждая водородная связь замыкает петлю из 13 атомов водорода — связи, которые стабилизируют спираль, почти параллельны длинной оси спирали; все карбонильные группы указывают на С-конец. кумулятивный эффект множества водородных связей внутри спирали стабилизирует эту конформацию, особенно в гидрофобных областях внутри белка, где нет молекул воды, которые могли бы конкурировать за водородные связи. боковые цепи аминокислот в спирали направлены наружу от цилиндра спирали.

11 Боковые цепи влияют на стабильность спирали: аланин имеет небольшую незаряженную боковую цепь, поэтому хорошо вписывается в спираль и часто находится в спиралях глобулярных белков. глицин, имеет боковую цепь -H, и дестабилизирует спирали, потому что вращение вокруг α-углерода настолько неограниченно, что пролин никогда не обнаруживается внутри α-спиралей. Он имеет жесткую циклическую боковую цепь, которая вызывает стерические помехи. Также отсутствует амид водорода для водородной связи с карбонильным кислородом другого а.а. по спирали. а-спирали обычно заканчиваются структурами, известными как сигнал остановки спирали (например, закрывающая коробка). боковая цепь N-концевого остатка (n) спирали взаимодействует с амидным водородом основной цепи четвертого остатка спирали, в результате чего образуется конформация, углы f и y которой несовместимы с образованием спирали. –Серин и треонин обычно находятся в начальном положении укупорочного бокса, а глутамат часто является четвертым остатком. Глобулярные белки различаются по своему a-спиральному содержанию: в миоглобине 75% остатков, обнаруженных в a-спиралях, химотрипсин очень мало, среднее значение для глобулярных белков составляет 26%.Амфипатические спирали = имеют гидрофильные аминокислоты на одной стороне цилиндра спирали и гидрофобные аминокислоты на противоположной стороне. Такие амфипатические спирали часто располагаются на поверхности глобулярных белков.

12 β-части полипептидной цепи, которые почти полностью вытянуты, включают b-цепи и b-листы. b листы состоят из множества b нитей, расположенных в листах. стабилизированные Н-связью между карбонильными атомами кислорода и амидными атомами водорода на соседних b-цепях (одного или разных полипептидов). β-цепи могут быть параллельными или антипараллельными.Параллельные нити менее стабильны из-за искаженных Н-связей. в β-листах боковые цепи указывают попеременно выше и ниже плоскости листа. β-листы могут содержать 2-15 прядей и могут образовывать бочкообразные структуры

Количественное определение белка

Гарантия

Позволяет выявлять и снижать внутренний риск для ваших операций, цепочек поставок и бизнес-процессов.
Узнать больше

Тестирование

Оценка того, насколько ваши продукты и услуги соответствуют стандартам качества, безопасности, устойчивости и производительности и превосходят их.
Узнать больше

Инспекция

Проверка характеристик, стоимости и безопасности вашего сырья, продуктов и активов.
Узнать больше

Сертификат

Официальное подтверждение того, что ваши продукты и услуги соответствуют всем проверенным внешним и внутренним стандартам.
Узнать больше

.