ГОСТ Р 54949-2012 Корма для животных. Определение содержания витамина Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Определение витамина е в кормах

ГОСТ Р 54949-2012 (ИСО 6867:2000) Корма для животных. Определение содержания витамина Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ГОСТ Р от 31 июля 2012 года №54949-2012

ГОСТ Р 54949-2012 (ИСО 6867:2000)

Группа С19

ОКС 65.120ОКСТУ 9209

Дата введения 2013-07-01

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП") на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 004 "Комбикорма, белково-витаминно-минеральные концентраты, премиксы"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 июля 2012 г. N 211-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 6867:2000* "Корма для животных. Определение содержания витамина Е. Метод с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии" (ISO 6867:2000 "Animal feeding stuffs - Determination of vitamin E content - Method using high-performance liquid chromatography") путем изменения отдельных фраз, слов, наименований единиц измерения, ссылок, которые в тексте стандарта выделены курсивом**. При этом потребности национальной экономики Российской Федерации и особенности Российской национальной стандартизации учтены в дополнительных подразделах 5.8-5.19, которые выделены путем заключения их в рамки из тонких линий, а информация с объяснением включения этих положений приведена в виде примечаний.________________* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru;** В бумажном оригинале обозначения и номера стандартов и нормативных документов в разделе "Предисловие", приложении ДА и в рамках приводятся обычным шрифтом, отмеченные в этих разделах знаком "**" и остальные по тексту документа выделены курсивом. - Примечание изготовителя базы данных. Структура национального стандарта соответствует структуре международного стандарта, за исключением подразделов 5.4 и 8.3, которые разбиты на пункты для использования ссылок на описание прибора и повторяющиеся этапы испытаний соответственно, раздел 2 дополнен ссылками на национальные и межгосударственные стандарты для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3), и сведениями о соответствии ссылочных национальных и межгосударственных стандартов международным стандартам, использованным в качестве ссылочных в примененном международном стандарте.Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с правилами, установленными ГОСТ Р 1.5 (подраздел 3.5), ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта приведено в дополнительном приложении ДА

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕПравила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012** (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма для животных и устанавливает метод определения содержания витамина Е (DL--токоферола) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб (ИСО 6498:1998, MOD)ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1-90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условияГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условияГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. ИспытанияГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условияГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия.ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условияГОСТ 9293-74 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условияГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условияГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора пробГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условияГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размерыГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требованияПримечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется принять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

________________* В бумажном оригинале наименование раздела 3 выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.Сущность метода заключается в омылении анализируемой пробы водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витамина Е петролейным эфиром, выпаривании петролейного эфира и растворении полученного остатка в гексане. Содержание витамина Е в гексановом экстракте определяют с помощью ВЭЖХ нормальными фазами, используя условия разделения DL--токоферола и других токоферолов, выраженное в международных единицах на килограмм (МЕ/кг).

4 Реактивы

4.1 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.2 Калия гидроокись (КОН) по ГОСТ 24363, раствор с массовой долей 50%

500 г гидроокиси калия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см (см. 5.17), растворяют в дистиллированной воде (см. 4.1) и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

4.3 Спирт этиловый ректификованный () по ГОСТ Р 51652 объемной долей 95% или эквивалентный технический метилированный спирт.

4.4 Гексан специальной марки для ВЭЖХ.

4.5 Эфир петролейный, интервал температур кипения от 40°C до 60°C, остаток после выпаривания должен быть не более 20 мг/дм.

4.6 Стандартный образец витамина Е: DL--токоферол, чистотой не менее 96,0%. Чистота стандартного образца должна проверяться с помощью спектрофотометрического метода (см. 8.5.2).

4.7 1,4-диоксан специальной марки для ВЭЖХ.

4.8 Натрий сернокислый () по ГОСТ 4166, безводный.

4.9 Натрия аскорбат, раствор с массовой концентрацией 100 г/дм.

4.10 Инертный газ, например, азот по ГОСТ 9293.

4.11 Подвижная фаза для жидкостной хроматографииСмешивают 1,4-диоксан (см. 4.7) и гексан (см. 4.4) в соотношении 30:970 по объему. Смешанный раствор перед применением фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.5).

4.12 Спирт этиловый ректификованный () по ГОСТ Р 51652 с объемной долей 96%.

4.13 Спирт метиловый () специальной марки для ВЭЖХ.Примечание - Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

5 Средства измерений, оборудование и материалы

________________* В бумажном оригинале наименование раздела 5 выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее:

5.1 Хроматограф высокоэффективный жидкостный, состоящий из следующего оборудования:

5.1.1 Насос, установленный для подачи элюента с постоянной объемной скоростью 1,5 см/мин.

5.1.2 Устройство для ввода ВЭЖХ.

5.1.3 Колонка длиной 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, набивная, неподвижная фаза состоит из кремнезема.Колонка считается удовлетворительной, если число теоретических тарелок не менее 5000, значение коэффициента емкости равно 0,8 в отношении DL--токоферола. Рекомендуемый размер частиц от 5 до 10 мкм.Допускается использовать другие системы при условии, что достигается удовлетворительное отделение витамина Е от других экстрагируемых с ним веществ.

5.1.4 Детектор, позволяющий производить измерение флуоресценции, испускаемой при длине волны 326 нм, если элюент колонки облучают ультрафиолетовым (УФ) светом при длине волны 293 нм, с интегратором (записывающим устройством).

5.2 Баня с кипящей водой.

5.3 Испаритель роторный вакуумный с водяной баней при температуре 40°C.

5.4 Аппарат для экстракции (см. рисунок 1), состоящий из следующего оборудования:

5.4.1 Цилиндр для экстракции вместимостью 1000 см со шлифом по ГОСТ 1770 и притертой пробкой.

5.4.2 Насадка, имеющая отводную трубку, обеспечивающая притертое соединение с цилиндром, оснащенная регулируемой сифонной трубкой (см. 5.4.3), проходящей по центру.

5.4.3 Трубка сифонная регулируемая с нижним концом U-образной формы для переноса верхнего слоя жидкости из цилиндра в делительную воронку вместимостью 1000 см.

Рисунок 1 - Пример аппарата для экстракции

1 - цилиндр со шлифом вместимостью 1000 см; 2 - слой петролейного эфира; 3 - водный слой с омыленной пробой корма; 4 - насадка, обеспечивающая притертое соединение с цилиндром; 5 - отводная трубка; 6 - регулируемая сифонная трубка

Рисунок 1 - Пример аппарата для экстракции

Допускается использовать для экстракции вместо аппарата, показанного на рисунке 1, конические колбы и делительные воронки при условии, что достигается удовлетворительный выход витамина Е.

5.5 Фильтр мембранный с размером пор 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы (см. 4.11) и растворов проб для испытания.

5.6 Мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода через сито с размером диаметра отверстий 1,0 мм.

5.7 Спектрометр в УФ-области спектра (или в УФ-видимой области спектра), обеспечивающий измерение поглощения при длине волны, определенной в 8.5.2, оснащенный кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 10 мм.

5.8 Сито с размером стороны квадратных ячеек 1,0 мм по ГОСТ Р 51568.5.9 Мясорубка с размером отверстий в пластинке 4,0 мм.5.10 Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с наибольшим пределом взвешивания 500 г и допускаемой погрешностью однократного взвешивания ±0,001 г.5.11 Колбы конические Кн-2-1000-42 ТХС по ГОСТ 25336.5.12 Холодильники стеклянные лабораторные обратимые по ГОСТ 25336.5.13 Воронки делительные ВД -1(2)-1000 ХС по ГОСТ 25336.5.14 Воронки фильтрующие ВФ-1(3)-100 ХС по ГОСТ 25336.5.15 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры.5.16 Колбы круглодонные К-2-250-34 ТХС по ГОСТ 25336.5.17 Колбы мерные 1(2)-25(100, 1000)-2 по ГОСТ 1770.5.18 Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-1-2 по ГОСТ 29227.5.19 Цилиндры мерные 1(2)-25(50, 100, 250, 1000) по ГОСТ 1770.Примечание - Пункты 5.8-5.19 введены дополнительно с учетом требований к перечню оборудования, необходимого для проведения испытания и применяемого в Российской Федерации.

6 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.Поступающая в лабораторию проба должна быть представительной, не поврежденной и не претерпевшей изменений во время транспортирования и хранения.Пробу должны хранить в условиях, предотвращающих ее порчу или изменение состава.

7 Подготовка проб для испытания

________________* В бумажном оригинале слово "испытания" в наименовании раздела 7 выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.Пробу для испытания готовят в соответствии с ГОСТ Р 51419.Непосредственно перед началом испытания лабораторную пробу тщательно перемешивают и измельчают на лабораторной мельнице (см. 5.6) до прохода через сито с размером отверстий 1,0 мм (см. 5.8). Снова тщательно перемешивают.Консервированные и влажные корма гомогенизируют, для чего лабораторную пробу пропускают через мясорубку с размером отверстий в пластинке 4,0 мм (см. 5.9) и тщательно перемешивают.

8 Проведение испытания

________________* В бумажном оригинале слово "испытания" в наименовании раздела 8 выделено курсивом. - Примечание изготовителя базы данных.

8.1 Общие положенияВвиду чувствительности витамина Е к УФ-излучению и воздуху все операции выполняют в местах, защищенных от сильного естественного и люминесцентного освещения, и по возможности быстро и аккуратно. Рекомендуется использовать янтарное стекло.Каждое испытание должно проводиться в течение одного рабочего дня.

8.2 ОмылениеНа лабораторных весах (см. 5.10) взвешивают (50±0,1) г пробы, подготовленной по 7, помещают в коническую колбу вместимостью 1000 см (см. 5.11).В коническую колбу с анализируемой пробой отмеряют при помощи цилиндра (см. 5.19) 200 см этилового спирта (см. 4.3) и, чтобы проба диспергировала, помешивают колбу круговыми движениями.Пипеткой (см. 5.18) добавляют 2 см раствора аскорбата натрия (см. 4.9), перемешивают круговыми движениями, затем добавляют 50 см раствора гидроокиси калия (см. 4.2) и снова перемешивают круговыми движениями. Подсоединяют к колбе обратимый холодильник (см. 5.12) и погружают колбу в кипящую водяную баню (см. 5.2).Колбу с содержимым и обратимым холодильником выдерживают на кипящей бане в течение 30 мин, время от времени помешивая круговыми движениями.Примечание - В исключительных случаях некоторые продукты могут потребовать более продолжительного омыления.Колбу извлекают из бани и охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды. Содержимое колбы переносят в цилиндр для экстракции (см. 5.4.1).

8.3 Экстракция витамина Е

8.3.1 Ополаскивают колбу для омыления двумя порциями по 25 см этилового спирта (см. 4.3) и переносят их в цилиндр для экстракции (см. 5.4.1).Повторяют ополаскивание колбы двумя порциями по 125 см петролейного эфира (см. 4.5) и одной порцией 250 см дистиллированной воды (см. 4.1), каждый раз перенося ополаскивающие порции в цилиндр. Закрывают цилиндр пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин, время от времени сбрасывая давление.Охлаждают цилиндр под струей холодной воды.После разделения двух жидких фаз пробку вынимают, смывают боковые стороны пробки небольшим количеством петролейного эфира и вставляют в цилиндр насадку (см. 5.4.2) с регулируемой сифонной трубкой (см. 5.4.3), располагая нижний открытый конец трубки прямо над уровнем границы разделения двух фаз.Путем приложения через отводную трубку (см. 5.4.2) небольшого давления с помощью инертного газа (см. 4.10) переносят верхний слой петролейного эфира в делительную воронку вместимостью 1000 см (см. 5.13).

8.3.2 В цилиндр добавляют 125 см петролейного эфира, закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин. Дают слоям разделиться и переносят верхний слой в ту же делительную воронку (см. 5.13) с помощью регулируемой сифонной трубки как описано в 8.3.1.

8.3.3 Повторяют этап экстракции витамина Е по 8.3.2.

8.3.4 Объединенные экстракты петролейного эфира промывают четырьмя порциями по 100 см дистиллированной воды, сначала немного наклоняя делительную воронку из стороны в сторону, потом слегка встряхивая, чтобы свести к минимуму образование эмульсии.

8.3.5 Промытый экстракт через воронку для фильтрования (см. 5.14), заправленную фильтровальной бумагой средней/быстрой фильтрации (см. 5.15) со слоем 30 г безводного сернокислого натрия (см. 4.8), переносят в круглодонную колбу для вакуумного выпаривания по ГОСТ 15336 (см. 5.16).Делительную воронку споласкивают двумя порциями по 20 см петролейного эфира и добавляют их через фильтр в колбу для выпаривания.Промывают фильтр еще двумя порциями по 25 см петролейного эфира и собирают смывы в колбу для выпаривания.

8.3.6 Петролейный эфир выпаривают из экстракта досуха на роторном испарителе (см. 5.4) под вакуумом при температуре не выше 40°C.Необходимо следить за тем, чтобы колбу извлекли из роторного испарителя немедленно после достижения точки высыхания, так как продолжительное высушивание может привести к потере витамина Е.Если концентрация витамина Е в экстракте петролейного эфира достаточно высока, экстракт можно довести до фиксированного объема петролейным эфиром и аликвотную часть взять для выпаривания. Атмосферное давление восстанавливают с помощью инертного газа (см. 4.10).Примечание - Нумерация пунктов введена с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний.

8.4 Определение

8.4.1 Остаток (см. 8.3.6) растворяют в минимальном объеме гексана (см. 4.4) и переносят количественно в мерную колбу вместимостью 25 см (см. 5.17).Колбу для выпаривания споласкивают тремя небольшими порциями гексана, перенося смывы в ту же мерную колбу. Доводят объем содержимого колбы до метки гексаном и перемешивают.При необходимости экстракт пробы фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.5) или центрифугируют.

8.4.2 Вводят 20 мм экстракта пробы в колонку жидкостного хроматографа (см. 5.1) и измеряют площадь пика DL--токоферола.Предлагаются следующие условия ВЭЖХ:- колонка для жидкостной хроматографии (см. 5.1.3) размером 250х4,6 мм, набивка - кремнезем с размером частиц от 5 до 10 мкм или равноценная;- подвижная фаза (см. 4.11): смесь гексана (см. 4.4) и 1,4-диоксана (см. 4.7) в соотношении 970:30 по объему;- скорость потока: 1,5 см/мин;- детектор флуоресценции (см. 5.1.4) (возбуждение при длине волны 295 нм, испускание при длине волны 330 нм).Допускается использовать другие условия, если они дают равноценный результат.Также можно использовать хроматографию обратными фазами при условии, что эффективность колонки достаточна, чтобы отделить DL--токоферол от других токоферолов и совместно экстрагируемых с витамином Е веществ из пробы. Если используют хроматографию обратными фазами, растворы пробы и стандартного образца необходимо разбавить подходящим растворителем, например, метиловым спиртом (см. 4.13).

8.4.3 Рассчитывают среднюю площадь пика по повторным вводам экстракта пробы и определяют концентрацию DL--токоферола в экстракте:

а) либо по ссылке на среднюю площадь пика, полученного при повторных вводах раствора стандартного образца DL--токоферола массовой концентрации в пределах 5% от концентрации в экстракте пробы,

б) либо по ссылке на градуировочную кривую, построенную по 8.5.

8.5 Градуировка

8.5.1 Приготовление градуировочных растворов стандартного образца DL--токоферола

8.5.1.1 Исходный раствор стандартного образца DL--токоферолаВ мерную колбу вместимостью 100 см помещают (100±0,1) мг DL--токоферола (см. 4.6) и растворяют гексаном (см. 4.4), доводя объем в колбе до метки. Исходный стандартный раствор устойчив в течение 1 недели, если хранить его при температуре не выше 4°C в герметично закрытой колбе из янтарного стекла.

8.5.1.2 Рабочий стандартный раствор DL--токоферола: одноточечная градуировкаГотовят рабочий стандартный раствор путем разбавления исходного стандартного раствора (см. 8.5.1.1) гексаном, чтобы получить массовую концентрацию, приблизительно равную ожидаемой в экстракте пробы. Альтернативно переходят к 8.5.1.3.

8.5.1.3 Рабочий стандартный раствор DL--токоферола: многоточечная градуировкаГотовят ряд градуировочных стандартных растворов в диапазоне массовых концентраций 2, 4, 6, 8 и 10 мкг/см DL--токоферола путем разбавления исходного стандартного раствора (см. 8.5.1.1) гексаном.Рабочие стандартные растворы готовят в день проведения испытания.

8.5.2 УФ-проверка стандартного образца DL--токоферола(100±0,1) мг DL--токоферола (см. 4.6) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в этиловом спирте (см. 4.12). Доводят объем до метки тем же растворителем и перемешивают.Разбавляют 2,0 см этого раствора в мерной колбе вместимостью 25,0 см этиловым спиртом (см. 4.12). Доводят объем до метки и измеряют УФ-спектр полученного раствора против этилового спирта (см. 4.12) на спектрометре (см. 5.7) при длине волны от 250 до 320 нм, максимальное поглощение должно происходить при длине волны 292 нм:75,8 при длине волны 292 нм в этиловом спирте.При таком разбавлении коэффициент ослабления должен получаться равным 0,6.

9 Обработка результатов

Содержание витамина Е в анализируемой пробе , МЕ/кг, вычисляют по формуле

, (1)

где 25 - коэффициент пересчета; - массовая концентрация DL--токоферола в экстракте, мкг/см; 1,1 - поправочный коэффициент для ацетата DL--токоферола; - масса анализируемой пробы по 8.2, г.

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторные испытанияРезультаты межлабораторных испытаний в отношении прецизионности метода определения содержания витамина Е в кормах приведены в приложении A. Значения, полученные в этих испытаниях, не могут быть применимы к диапазонам концентраций и образцам, отличающимся от описанных в данном стандарте

10.2 Повторяемость (сходимость)Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных независимых испытаний, полученными одним и тем же методом, на одной испытуемой пробе, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, на одном и том же оборудовании, в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости, , приведенный в таблице 1, более чем в 5% случаев.

10.3 ВоспроизводимостьАбсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом, на одной испытуемой пробе, в разных лабораториях, разными операторами, на различном оборудовании, не должно превышать предел воспроизводимости , приведенный в таблице 1, более чем в 5% случаев.Таблица 1 - Пределы повторяемости () и воспроизводимости ()


Наименование анализируемой пробы	Содержание витамина Е, МЕ/кг	Предел повторяемости , МЕ/кг	Предел воспро-изводимости , МЕ/кг
Корм для крупного рогатого скота	23,1	1,36	3,51
Корм для птицы	29,7	2,07	10,02
Корм для свиней	64,9	4,06	17,44
Корм для животных А* (рацион 722)	78,0	4,94	18,31
Корм для животных В* (рацион 748)	140,6	15,73	43,91
Консервированный корм для домашних питомцев	20,6	0,98	7,46
Влажный корм для домашних питомцев	180,4	15,23	29,70
Сухой корм для домашних питомцев	78,7	4,22	16,97
* Рассчитано на абсолютно сухое вещество.

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен включать следующее:- всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;- используемый метод отбора проб, если известен;- используемый метод определения со ссылкой на настоящий стандарт;- все детали испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;- полученный результат испытания или среднеарифметическое значение результатов двух испытаний, если проверена повторяемость.

Приложение A (справочное). Результаты межлабораторных испытаний

Приложение A(справочное)

Прецизионность метода была установлена в ходе межлабораторных испытаний, выполненных в соответствии с [1], [2]. Результаты этих испытаний опубликованы в [3]. В испытаниях приняло участие 10-12 лабораторий. Были исследованы следующие пробы: корм для крупного рогатого скота - 1, корм для птицы - 2, корм для свиней - 3, корм для животных А (рацион 722) - 4*, корм для животных В (рацион 748) - 5*, консервированный корм для домашних питомцев - 6, влажный корм для домашних питомцев - 7, сухой корм для домашних питомцев - 8.Статистические результаты межлабораторных испытаний приведены в таблице A.1.

Таблица A.1 - Статистические результаты межлабораторных испытаний


Наименование показателя	Значение показателя для проб
	1	2	3	4*	5*	6	7	8
Количество лабораторий	10	10	10	12	12	11	11	11
Количество отдельных результатов	20	20	20	24	24	22	22	22
Количество принятых результатов	14	16	16	18	18	14	14	14
Среднее значение содержания витамина Е, МЕ/кг	23,11	29,66	64,94	78,03	140,63	20,55	180,39	78,66
Стандартное отклонение повторяемости, , МЕ/кг	0,44	0,69	1,35	1,66	5,27	0,32	4,98	1,38
Коэффициент вариации повторяемости, %	1,92	2,32	2,07	2,12	3,75	1,56	2,76	1,76
Предел повторяемости, (), МЕ/кг	1,36	2,07	4,06	4,94	15,73	0,98	15,23	4,22
Стандартное отклонение воспроизводимости, , МЕ/кг	1,15	3,33	5,79	6,13	14,72	2,44	9,72	5,55
Коэффициент вариации воспроизводимости, %	4,97	11,21	8,91	7,86	10,46	11,89	5,39	7,06
Предел воспроизводимости, (), МЕ/кг	3,51	10,02	17,44	18,31	43,91	7,46	29,70	16,97
* Рассчитано на абсолютно сухое вещество.

Приложение ДА (справочное). Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта

Приложение ДА(справочное)

Таблица ДА.1


Структура настоящего стандарта			Структура международного стандарта
Подраздел	Пункт	Подпункт	Подраздел	Пункт	Подпункт
Раздел 5			Раздел 5
5.1	5.1.1	-	5.1	5.1.1	-
-	5.1.2	-	-	5.1.2	-
-	5.1.3	-	-	5.1.3	-
-	5.1.4	-	-	5.1.4	-
5.2	-	-	5.2	-	-
5.3	-	-	5.3	-	-
5.4	5.4.1	-	5.4	-	-
-	5.4.2	-	-	-	-
-	5.4.3	-	-	-	-
5.5	-	-	5.5	-	-
5.6	-	-	5.6	-	-
5.7	-	-	5.7	-	-
5.8	-	-	-	-	-
5.9	-	-	-	-	-
5.10	-	-	-	-	-
5.11	-	-	-	-	-
5.12	-	-	-	-	-
5.13	-	-	-	-	-
5.14	-	-	-	-	-
5.15	-	-	-	-	-
5.16	-	-	-	-	-
5.17	-	-	-	-	-
5.18	-	-	-	-	-
5.19	-	-	-	-	-
Раздел 8			Раздел 8
8.1	-	-	8.1	-	-
8.2	-	-	8.2	-	-
8.3	8.3.1	-	8.3	-	-
-	8.3.2	-	-	-	-
-	8.3.3	-	-	-	-
-	8.3.4	-	-	-	-
-	8.3.5	-	-	-	-
-	8.3.6	-	-	-	-
8.4	8.4.1	-	8.4	8.4.1	-
-	8.4.2	-	-	8.4.2	-
-	8.4.3	-	-	8.4.3	-
8.5	8.5.1	8.5.1.1	8.5	8.5.1	8.5.1.1
-	-	8.5.1.2	-	-	8.5.1.2
-	-	8.5.1.3	-	-	8.5.1.3
-	8.5.2	-	-	8.5.2	-
Приложение ДА (справочное). Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта			-
Примечания1 Сопоставление структуры стандартов приведено, начиная с раздела 5, так как предыдущие разделы стандартов и их иные структурные элементы (за исключением предисловия) идентичны.2 В разделе 5 (подраздел 5.4) настоящего стандарта введена нумерация пунктов 5.4.1-5.4.3 для использования ссылок на них по тексту.3 В раздел 5 настоящего стандарта добавлены подразделы 5.5-5.19 с учетом требований к дополнительному оборудованию, используемому в России.4 В разделе 8 (подраздел 8.3) настоящего стандарта, введена нумерация пунктов 8.3.1-8.3.6 с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний.5 В соответствии с ГОСТ 1.7-2008* в настоящий стандарт включено дополнительное приложение ДА "Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта".

________________* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ Р 1.7-2008. - Примечание изготовителя базы данных.

Библиография


[1]	ИСО 5725-1:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 1. Общие принципы и определения
[2]	ИСО 5725-2:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения
[3]	Analytical Methods Committee, Analyst, 116, 191, pp.421-430

______________________________________________________________________УДК 636.085.3:006.354 ОКС 65.120 С19 ОКСТУ 9209Ключевые слова: корма для животных, витамин Е (DL--токоферол), содержание, сущность метода, высокоэффективная жидкостная хроматография, омыление, экстракция, петролейный эфир, гексан, этиловый спирт, прямая фаза, проведение испытания, обработка результатов, прецизионность, протокол испытания______________________________________________________________________

Электронный текст документа подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:официальное изданиеМ.: Стандартинформ, 2014

docs.cntd.ru

ГОСТ 32043-2012 Премиксы. Методы определения витаминов А, D,...

Действующий

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Методы определения витаминов A, D, Е

Premixes. Methods for determination of vitamin A, D, E

Дата введения 2014-07-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 004)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 54-П от 3 декабря 2012 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по MК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. N 306-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32043-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на премиксы с различными наполнителями и устанавливает хроматографические методы определения содержания витаминов А (ретинола ацетата), D (D2 эргокальциферола и D3 холикальциферола), Е (токоферола ацетата).

Метод с использованием обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии применим при содержании в премиксах витамина А в диапазоне от 40 до 6000 млн. МЕ/т, витамина Е - от 50 до 1000 г/т.

Метод с использованием нормально-фазной высокоэффективной хроматографии - при содержании в премиксе витамина А в диапазоне от 10 до 10000 млн. МЕ/т, витамина D2 - от 40 до 10000 млн. МЕ/т, витамина Е - от 10 до 10000 г/т.

Примечание - ME - международная единица измерения количества вещества, основанная на биологической активности витаминов.

1 ME витамина А соответствует 0,344 мкг ретинола-ацетата, витамина D - 0,025 мкг холе- или эргокальциферола.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 8677-76 Реактивы. Кальция оксид. Технические условия

ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31218-2003* (ИСО 6498:1998) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51419-99, здесь и далее по тексту.

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальный стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяют в части, не затрагивающей эту ссылку.

Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

4 Подготовка проб для испытаний

Подготовка проб - по ГОСТ 31218.

dokipedia.ru

Способ определения витаминов группы е

(72) Авторы изобретения

П. ф. Сурай н M. С. Жедек

Украинский научно-исследовательский институт птицеводс тва (7I ). Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ

ГРУППЫ Е

Изобретение относится к химическим

Методам определения витаминов группы Е (токоферолов) с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТХС) и может быть использовано при определении содержания токоферолов в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканях живот ных (например, для контроля их Е-витаминного кормления) в медипинских, вете ринарных и других биологических исследованиях, а также для контроля производства витамина Е.

Известен способ определения витаминов группы Е в биологическом материале . включающий экстракшпо общих липидов нз ткани органическими растворителями, выделение и очистку токоферола методом тонкослойной хроматографии, окисление его дотокоферилхинона и спектрофотометри- - 0 ческое определение послепнего (1).

Недостатком способа является его относительно невысокая чувствительность.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому ре зультату является способ определения витамина Е в биологическом объекте, заклю чающийся в том, что навеску материала омьпппот спиртовым раствором щелочи, экстрагируют иеомыляемые липкцы L эфиром и отмывают дистиллированной водой донейтральной реакции, высушивают эфирный экстракт сульфатом натрия, упаривают его, растворяют в малом объеме растворителя и наносит на специально приготовленные хроматографические пластинки с незакрепленным слоем, обнаруживают токоферолы при ультрафиолетовом облучении по свидетелю, снимают с пластинки слой адсорбента и ыпоируют витамин Е растворите-, лем, упаривают раствор витамина, раство ряют остаток в спирте, производят цветную реакцию и фотометрируют полученный раствор. Концентрацию витамина Е определяют по предварительно построенной колибровочной кривой f 2) .

3 9742

Недостатками известного способа являются длительность анализа, низкая точность н чувствительность.

Пель изобретения вЂ” сокращение длительности анализа, а также повышение точности и чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения витаминов группы Е путем омыления анализируе-мой пробы в присутствии "пирогаллола в l0 атмосфере азота при 90-95оС, экстракцни эфиром неомыляемой части пробы, высушивания эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хлороформе, с последующим тонкослой- IS ным хроматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографическую пластинку, после чего пластинку с хлороформным раствором обрабатывают цветореагентом - смесью р0

g- / -дипиридила и хлорного железа с последующим элюированием окрашенного адсорбированного слоя смесью содержащей этанол, соляную кислоту, фосфорную, кислоту и бидистиллированную воду, при ZS следующем соотношении компонентов, об.%:

Этанол 45 - 55

Соляная KHGJIoTG 20 вЂ” 30

Фосфорная кислота 6-10

Бидис тилированная 30 вода 5 - 29 и фотометрированием элюента.

Предлагаемый. способ позволяет селективно определять изомеры витаминов группы Е (токоферолов), причем локали; 35 зацию токоферолов a(,-изомера определяют по свидетелю, а p + ®Q нэомеров - по величине Ку

Пример. Определение витамина Е в печени индюков.

Наьеску гомогената печени (3-5г) переносят в колбочку для омыления, добавляют 50 мл этанола, 100 мг ггарагаппола, 5 мл 60%-ного раствора гидроксида калия, присоединяют обратный холодильник, продувают азот 6 7 мин и омыляют на глицериновой бане 20 мин при 90

95 Ñ. Затем охлаждают и трижды экстрагируют неомыляемую фракцию эфиром пор днями по 40 мл. Затем эфирный экстракт отмывают до нейтральной реакции дйстиллированной водой по бромтимоловому синему, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают в токе азота на роторном . испарителе. Далее сухой остаток растворяют в 0,1 - 0,2 мл хлороформа и микро»

Я шприцем (наыосят О,OS 0,1 мл раствора на стартовую линию хроматографической пластинки в вире полосы длиною 20

62 ф

30 мм. Рядом наносят свидетель-пример.но 3-5 мкг оС =токоферола.

Хрома тографическое разделение токоферолов на подготовленных пластинках осуществляют в камере, насыщенной . парами хлороформа, через которую в течение 15 мин продувают азот. Когда фронт растворителя приближается к верхнему краю пластинки, необходимо извлечь ее из камеры и высушить в токе азота при

35- 40 С. Затем обильно опрыскивают пластинку свежеприготовленным проявляющим раствором, состоящим из равных объемов 0,5%-ного раствора

Обработанную пластинку выдерживают в горизонтальном положении 5 вЂ” 7 мин, чтобы проявляющий раствор впитался адсорбентом и количественно прореагировал с витамином Е с образованием роэовокрасного пятна. Затем подсушивают пласо тинку в инертной атмосфере при 20-25 С определяют локализацию о -токоферола по свидетелю и количественно переносит окрашенный участок адсорбента в пробирку с притертой пробкой.

Затем в пробирку приливают 3 мл

; элюирующей смеси, состоящей иэ этанола, соляной и фосфорной кислот и бидистиллата в объемных соотношениях 6: 3: 1: 2, энергично встряхивают 15 - 20 с и филь| ° руют через обеззоленный фильтр (красная лента). Сполоснув пробирку 1 мл этой же смеси, переносят ее на тот же фильтр.

Полученный розовый фильтрат фотометридчот при - 530 нм, по сравнению с элюирующей смесью. Содержание витамина Е вычисляют по формуле

Ч 9 ч„ где Е - содержание сС.-токоферола в ткани, мкг/г; - объем хлороформа, в котором растворена проба, мл;

V - объем хлороформенного раствора, 1 нанесенного на пластинку, мл; у навеска субстрата> г

g - количество g -токоферола по калибровочному графаку.

Пример 2. Определение иэомеров токоферола в травяной муке. .Навеску травяной муки (1-2 г) переносят в копбочку с притертой пробкой, заливают 100 мл эфира и,ac.òðàõèâàþò иа шюттель-аппарате 20 мий. Затем филь руют и упаривают эфир в атмосфере азота иа роторном исцарителе. Сухой остаток

Предлагаемый 30,94+0, 158 6

56,7 2-60

Извес т ный

24,6+0,82 6

82, 9 159 14-40

Таблица 2

Содержание компонентов в смеси, об.%

Компонент

40 42 45 50 55 58

Э танол

25 25 25 25

8 8. 8 8

27 22 22 17

25 25

8 8

12 9

Соляная кислота

Фосфорная кислота

Бидис тиллат

Определение,С -токоферола, % 88,4 94,8 98, 9 100 98, 7 93,6 90, 1

50 SO 50 50 50 50 SO

1S 17 20 25 30 33 35

Этанол

Соляная кислота

Фосфорная кислота .8 8 8 8 8 8 8

Бидис тиллат 27 25 22 17 12 9 7

Определение о . -токорола, %

90,1 : 93,2 97,9 100 98,2 94,6 90,0

50 50 50

2S 25 25

2. 4 6

23 21 19

Этанол

Соляная кислота

50 50 50 50

25 25 25 25

8 .10 15 20

17 1S 5

Фосфорная кислота

Бидистиллат

79,6 90, 1 99,4 100 99,6, 92,6 90, 1

Определение -токоферола, %

5 97426

pBcTBopfiloT в 0,05 -0,1 мл хлороформа и . микрошприцом наносят 0,025 - 0,05 мл этого раствора на стартовую линию хроматографической пластинки (пластинку не нагревать!) в виде полосы, длиною 4080 мм. Рядом наносят свидетель, содержаший примерно 3- 5 мкг ос. -токоферола.

Процедуры хроматографирования, опрыскивания и подсушивания пластинки такие же, как и при определении витамина Е в пе- >4 чени, определяют локализацию токоферолов сС-изомерК по свидетелю. а P + -по величине Ку .. Все дальнейшие процедуры такие же, как и определение витаминав примере 1. При отсутствии специальных 1% свидетелей допустимо определение концентрации изомеров по калибровочному графи ку построенному по о -токоферолу.

На пластинках "Силуфол" разделяется

3-40 мкг витамина Е. Если интенсивность окраски пятна мала, цветной комп- лекс элюируют из нескольких пластинок.

При элюировании пятен спирто-водным раствором кислот расхождения между параллелями не превышают 1% и окраска элюита устойчива 15-20 мин.

Сравнительные данные определения о(.-токоферола в желтке индюшиных яиц приведены в табл. 1.

В табл. 2 приведено определение допустимых пределов состава вешества.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа. Вследствие его большей точности, чувствителт ности и селективности по сравнению с

%, известным способом удобно его исполь- . зование для определения изомеров токо феролов в травиной муке, витаминная ценность которой определяется не суммой изомеров, а содержанием только (.-токоферола, что позволяет более рационально использовать Е-витаминные корма. Табли ца 1

7 974

Ф орм ула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кейфах Е. А., Буробина С. А.

Is Количественный метод определения токоферола и его производных в тканях животных. - "Вопросы медицинской химии".

1967, т.XtN., М 1, с. 94 - 97.

2. Крюков.В. С., Дмитровский А. А. е и др. Определение витаминов А. Е и каротиноидов в кормах,, препаратах и биологических объектах. Методические рекомендации ВНИТПП, Загорск,1978, с. 3-.

23.

Составитель

: Редактор Н. Киштулинец Техред М.Тенер

Корректор И. Ватрушкииа

Зз 8686/61 Тираж 887 - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ определения витаминов группы Е путем омыления анализируемой пробы, экстракции эфиром неомыляемой час ти пробы, высушиваиия эфирного экстракта, выпаривания и растворения полученного остатка в хлороформе с последующим тонкослойным хроматографическим разделением полученного раствора путем нане сенин его на хроматографическую пластинку с использованием элюирования ад,. сорбированного слоя, обработки цветореагентом и фотометрирования элюента, ! о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью сокращения длительности анализа,, 1 повышения точности и чувствительности способа, омыление ведут в присутствии пирогаллола в атмосфере азота при 90

95 С и пластинку с хлороформным раствором обрабатывают цветореагентом,смесью aL,- с -дипиридила и хлорного

S железа с последующим элюированием окрашенного адсорбированного uioa сме

262 8 сью содержащей этанол соляную кисло.ту фосфорную кислоту и бидистиллирован-" ную воду, при следующем соотношении компонентов, об. %:

Этанол 45 - 55

Соляная кислота 20- 30

Фосфорная кислота 6 - 10

Бидистиллированная вода

5-29

10 и фотометрированием элюента.

www.findpatent.ru

Витамин Е в кормлении животных

Природные источники и их применение

Витамин Е (сборное понятие для различных соединений токоферолов и токотринолов) содержится в растениях и животных тканях. При этом решающим является не общее содержание токоферолов, но содержание альфа-токоферола.

Витамином Е богаты: луговая трава, клевер, люцерна, травяная мука, неизмельченные семена.

Мало витамина Е в шротах маслянистых культур.

Влажность и длительность хранения негативно влияют на стабильность витамина Е и его содержание. Особенно это заметно на консервированных зелёных кормах и зерновых культурах.

В зерновых и продуктах их переработки биологическая активность содержащихся в них от 70 до 90% бета-, гамма- и сигма-токоферолов, значительно ниже по сравнению с альфа-токоферолами.

Таблица 1. Биологическая активность различных соединений витамина Е:

Альфа-токоферол	100%
Бета-токоферол	15-40%
Гамма-токоферол	1-20%
Сигма-токоферол	1%
Альфа-токотринол	15-30%
Бета-токотринол	1-5%
Гамма-токотринол	1%
Сигма-токотринол	1%

Физиологическое значение

Предотвращение образование липидных пероксилрадикалов из полиненасыщенных жирных кислот
Антиоксидантное действие в обмене веществ клеток
Предотвращение некрозов печени и дегенерации мышц
Антиокислительное действие благодаря стабилизации подверженных окислению фосфолипидов в клеточных мембранах и других подверженных сильному окислению веществах, таких как витамин А, каратиноиды и их промежуточные ступени. Касательно защиты от окисления клеточных мембран существует тесная связь между витамином Е и селеном. В то время, как витамин активно действует в клеточных мембранах, действие селена базируется на разложении пероксидов посредством глутатионпероксидазы в растворимых частях клетки. Для достаточного образования селеносодержащей глутатионпероксидазы необходимо содержание селена в количестве 0,2-0,3 мг/кг сухого вещества корма.
Регуляция гормонального обмена веществ через передние доли гипофиза.
Поддержание стабильности мембран, особенно сердечной и скелетной мускулатуры.
Регуляция развития и функций половых желез.
Стимуляция образования антител (лучшая резистентность от заболеваний) и фагоцитоз, а также бактерицидное действие фагоцитов.
Подготовка и защита беременности

Проявления недостаточности витамина Е

Повреждения мускулатуры сердечной и скелетной (дистрофия, миопатия)
Внезапная смерть от сердечного удара при повреждении сердечной мышцы
Нарушения плодовитости
Изменения в сердечно-сосудистой или нервной системах
Повреждения печени и изменения в жировом депо (коричневый окрас сала у свиней)
Для свиней: нарушения движений и мышечные судороги
У телят и ягнят: белое мясо из-за дистрофических изменений
У птицы: сниженное количество вылупливания цыплят, екссудативный диатез.

Дополнительные эффекты

Стабилизация жира (защита от окисления) в продуктах животного происхождения (мясо, молоко, яйца)

—————————————————

Раздел 2.1.4 из брошюры «Витамины в кормлении животных», издатель рабочая группа по кормовым добавкам в кормлении животных (AWT), 2001. Перевод Елены Бабенко для soft-agro.com

Скачать в формате .pdf

С нетерпением жду отзывы и комментарии. Большое Вам спасибо!

КАК УПРАВЛЯТЬ КАЧЕСТВОМ СЫРЬЯ - ОБУЧАЮЩИЙ КУРС

ПОЛЕЗНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ПО КОРМЛЕНИЮ Получайте практическую информацию 1 раз в неделю на Ваш e-mail:

soft-agro.com

ГОСТ Р 54949-2012 Корма для животных. Определение содержания витамина Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

2012

Определение содержания витамина Е методом высокоэффективной жидкостной

хроматографии

ISO 6867:2000

Animal feeding stuffs — Determination of vitamin E content — Method using high-performance liquid chromatography

(MOD)

Издание официальное

Москва

Стенда ртмнформ 2014

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»)наоснове аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 004 «Комбикорма, белково-витамин-но-минеральные концентраты, премиксы»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 июля 2012 г. № 211 -от

4 Настоящий стандарт является модифицированным поогношению «международному стандарту ИСО 6867:2000 «Корма для животных. Определение содержания витамина Е. Метод с применением высокоаффективной жидкостной хроматографии» (ISO 6867:2000 «Animal feeding stuffs — Determination of vitamin E content — Method using high-performance liquid chromatography») путем изменения отдельных фраз. слов, наименований единиц измерения, ссылок, которые в тексте стандарта выделены курсивом. При этом потребности национальной экономики Российской Федерации и особенности Российской национальной стандартизации учтены в дополнительных подразделах 5.8—5.19. которые выделены путем заключения их в рамки из тонких линий, а информация собъяснекием включения этих положений приведена в виде примечаний.

Структура национального стандарта соответствует структуре международного стандарта, за исключением подразделов 5.4 и 8.3, которые разбиты на пункты для использования ссылок на описание прибора и повторяющиеся этапы испытаний соответственно, раздел 2 дополнен ссылками на национальные и межгосударственные стандарты для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3), и сведениями о соответствии ссылочных национальных и межгосударственных стандартов международным стандартам, использованным в качестве ссылочных в примененном международном стандарте.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с правилами, установленными ГОСТ Р1 ^(подраздел 3.5). ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта приведено в дополнительном приложении ДА

5 8ВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0—2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — е ежемесячном информационном указателе «Национальные стан-дарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано е ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

Содержание

Приложение ДА (справочное) Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой

ГОСТ Р 54949—2012 (ИСО 6867:2000)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Определение содержания витамина Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Animal feeding stuffs. Determination of vitamin E content by high-performance liquid chromatography method

Дата введения — 2013—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма для животных и устанавливает метод определения содержания витамина Е (DL-ы-токоферола) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2 Нормативные ссылки

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51419—99 (ИСО 6498—98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб (ИСО 6498:1998. MOD)

ГОСТ Р 51568—99 (ИСО 3310-1—90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 51652—2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р S3228—2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770—74 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166—76 Реактивы. Натрийсернокислый.Техническиеусловия.

ГОСТ 6709—72 вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9293—74(ИСО 2435—73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026—76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0—80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 24363—80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов а информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии а сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию не 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты* за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех снесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на кото-

Издание официальное

рый дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта а ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применятьбез учета данного изменения. Еслиссылочный стандарт отменен без замены, то положение. в котором дана ссылка не него, рекомендуется принять в части, не затрагивающей эту ссыпку.

3 Сущность метода

Сущность метода заключается в омылении анализируемой пробы водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витамина Е петролейным эфиром, выпаривании петролейного эфира и растворении полученного остатка в гексане. Содержание витамина Е в гексановом экстракте определяют с помощью ВЭЖХ нормальными фазами, используя условия разделения DL-a-токоферола и других токоферолов, выраженное в международных единицах на килограмм (МЕ/кг).

4 Реактивы

4.1 Вода дистиллированная по ГОСТ6709.

4.2 Калия гидроокись (КОН) по ГОСТ 24363, раствор с массовой долей 50 %

500 г гидроокиси калия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3 (см. 5.17), растворяют в дистиллированной воде (см. 4.1) и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

4.3 Спирт этиловый ректификованный (C2HsOH) ло ГОСТ Р 51652 объемной долей 95 % или эквивалентный технический метилированный спирт.

4.4 Гексан специальной марки для ВЭЖХ.

4.5 Эфир летролейный. интервал температур кипения от 40 вС до 60 *С. остаток после выпаривания должен быть не более 20 мг1дм3.

4.6 Стандартный образец витамина Е: DL-a-токофврол. чистотой не менее 96.0 %. Чистота стандартного образца должна проверяться с помощью спектрофотометрического метода (см. 6.5.2).

4.7 1,4-диоксан специальной марки для ВЭЖХ.

4.8 Натрий сернокислый(Na2S04) лоГОСТ4166, безводный.

4.9 Натрия аскорбат, раствор с массовой концентрацией с - 100 г/дм3.

4.10 Инертный газ. например, азот ло ГОСТ 9293.

4.11 Подвижная фаза для жидкостной хроматографии

Смешивают 1.4-диоксан (см. 4.7) и гексан (см. 4.4) в соотношении 30:970 ло объему. Смешанный раствор перед применением фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.5).

4.12 Спирт этиловый ректификованный (С2Н5ОН) ло ГОСТ Р 51652с объемной долей 96%.

4.13 Спирт метиловый (СН3ОН) специальной марки для ВЭЖХ.

Примечание — все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. в.

5 Средства измерений, оборудование и материалы

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее:

5.1 Хроматограф высокоэффективный жидкостный, состоящий из следующего оборудования:

5.1.1 Насос, установленный для подачи элюента с постоянной объемной скоростью 1.5 см^/мин.

5.1.2 Устройство для ввода ВЭЖХ.

5.1.3 Колонка длиной 250 мм с внутренним диамвгром4.6 мм. набивная, неподвижная фаза состоит из кремнезема.

Колонка считается удовлетворительной, если число теоретических тарелок не менее 5000. значение коэффициента емкости нравно 0.8 в отношении DL-чх-токоферола. Рекомендуемый размер частиц от5до10мкм.

Допускается использовать другие системы при условии, что достигается удовлетворительное отделение витамина Е от других экстрагируемых с ним веществ.

5.1.4 Детектор, позволяющий производить измерение флуоресценции, испускаемой при длине волны 326 нм. если элюент колонки облучают ультрафиолетовым (УФ) светом при длине волны 293 нм. с интегратором (записывающим устройством).

5.2 Баня с кипящей водой.

5.3 Испаритель роторный вакуумный с водяной баней при температуре 40 *С.

5.4 Аппарат для экстракции (см. рисунок 1), состоящий из следующего оборудования:

5.4.1 Цилиндр для экстракции вместимостью 1000 си3 со шлифои по ГОСТ 1770 и притертой пробкой.

5.4.2 Насадка, имеющая отводную трубку, обеспечивающая притертое соединение с цилиндром. оснащенная регулируемой сифонной трубкой (си. 5.4.3). проходящей по центру.

5.4.3 Трубка сифонная регулируемая снижним концом U-образной формы для переноса верхнего слоя жидкости из цилиндра в делительную воронку вместимостью 1000см3.

Г — цилиндр со шпифоивместимостью 1000 ем ; 2 — слой легропейного эфира. 3 — водный спой с опыленной пробой корма: 4 — насадка, обеспечивающая притертое соединение с цилиндром; 5 — отводная трубка; в — регулируемая сифонная трубка

Рисунок 1 — Пример аппарата для экстракции

Допускается использовать для экстракции вместо аппарата, показанного на рисунке 1. конические колбы и делительные воронки при условии, что достигается удовлетворительный выход витамина Е.

5.5 Фильтр мембранный с размером лор 0.45 мкм для фильтрования подвижной фазы (см. 4.11) и растворов проб для испытания.

5.6 Мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода через сито с размером диаметре отверстий 1.0 мм.

5.7 Спектрометр в УФ-области спектра (или в УФ-видимой области спектра), обеспечивающий измерение поглощения при длине волны, определенной в 8.5.2. оснащенный кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 10 мм.

5.6 Сито с размером стороны квадратных ячеек 1,0 мм по ГОСТ Р 51568.

5.9 Мясорубка с размером отверстий в пластинке 4.0 мм.

5.10 Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с наибольшим пределом взвешивания 500 г и допускаемой погрешностью однократного взвешивания ± 0.G01 г.

5.11 Колбы конические Кн-2-1000-42 ТХС по ГОСТ 25336.

5.12 Холодильники стеклянные лабораторные обратимые по ГОСТ 25336.

5.13 Воронки делительные ВД -1(2)-1000 ХС по ГОСТ 25336.

5.14 Воронки фильтрующие ВФ-1(3)-100 ХС по ГОСТ 25336.

5.15 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры.

5.16 Колбы круглодонные К-2-250-34 ТХС по ГОСТ 25336.

5.17 Колбы мерные 1(2)-25(100.1000)-2 по ГОСТ 1770.

5.18 Пипетки градуированные 1(2. 3. 5)-1(1а. 2.2а>-1-2 по ГОСТ 29227.

5.19 Цилиндры мерные 1(2)-25{50,100.250.1000) по ГОСТ 1770.

Примечание — Пункты 5.8—S.19 введены дополнительно с учетом требований к перечню оборудования. необходимого для проведения испытания и применяемого в Российской Федерации.

6 Отбор проб

Отбор проб — поГОСТ 13496.0.

Поступающая в лабораторию проба должна быть представительной, не поврежденной и не претерпевшей изменений во время транспортирования и хранения.

Пробу должны хранить в условиях, предотвращающих ее порчу или изменение состава.

7 Подготовка проб для испытания

Пробу для испытания готовят в соответствии с ГОСТР 51419.

Непосредственно перед началом испытания лабораторную пробу тщательно перемешивают и измельчают на лабораторной мельнице (см. 5.6) до прохода через сито с размером отверстий 1.0 мм (см. 5.6). Снова тщательно перемешивают.

Консервированные и влажные корма гомогенизируют, для чего лабораторную пробу пропускают через мясорубку с размером отверстий в пластинке 4.0 мм (см. 5.9) и тщательно перемешивают.

8 Проведение испытания

8.1 Общие положения

Ввиду чувствительности витамина Е кУФ-иэлучеиию и воздуху все операции выполняют в местах, защищенных от сильного естественного и люминесцентного освещения, и по возможности быстро и аккуратно. Рекомендуется использовать янтарное стекло.

Каждое испытание должно проводиться в течение одного рабочего дня.

8.2 Омыление

На лабораторных весах (см. 5.10) взвешивают (50 ±0.1) г пробы, подготовленной по 7. помещают в коническую колбу вместимостью 1000 см3 (см. 5.11).

В коническую колбу с анализируемой пробой отмеряют при помощи цилиндра (см. 5.19) 200 см3 зтиловогоспирта(см. 4.3)и,чтобы проба диспергировала, помешивают колбу круговыми движениями.

Пипеткой (см. 5.18) добавляют 2 см3 раствора аскорбата натрия (см. 4.9), перемешивают круговы* ми движениями, затем добавляют 50 см3 раствора гидроокиси калия (см. 4.2) и снова перемешивают круговыми движениями. Подсоединяют к колбе обратимый холодильник (см. 5.12) и погружают колбу в кипящую водяную баню (см. 5.2).

Колбу с содержимым и обратимым холодильником выдерживают на кипящей бане в течение 30 мин. время от времени помешивая круговыми движениями.

Применение — В исключительных случаях некоторые продукты могут потребовать более продолжительного омыления.

Колбу извлекают из бани и охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды.

Содержимое колбы переносят в цилиндр для экстракции (см. 5.4.1).

8.3 Экстракция витамина Е

8.3.1 Ополаскивают колбу для омыления двумя порциями по 25 см3 зтилоеогоспирта(см. 4.3) и переносят их в цилиндр для экстракции (см. 5.4.1).

Повторяют ополаскивание колбы двумя порциями по 125 см3 петролейного эфира (см. 4.5) и одной порцией 250 см3 дистиллированной воды (см. 4.1), каждый раз перенося ополаскивающие порции в цилиндр. Закрывают цилиндр пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин. время от времени сбрасывая давление.

Охлаждают цилиндр под струей холодной воды.

После разделения двух жидких фаз пробку вынимают, смывают боковые стороны пробки неволь-шим количеством петролейного эфира и вставляют е цилиндр насадку (см. 5.4.2) с регулируемой сифонной трубкой (см. 5.4.3). располагая нижний открытый конец трубки прямо над уровнем границы разделения двух фаз.

Путем приложения через отводную трубку (см. 5.4.2) небольшого давления с помощью инертного газа (см. 4.10) переносят верхний спой петролейного эфира в делительную воронку вместимостью 1000см3 (см. 5.13).

8.3.2 В цилиндр добавляют 125 см3 петролейногоэфира. закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин. Дают слоям разделиться и перекосят верхний слой в ту же делительную воронку (см. 5.13) с помощью регулируемой сифонной трубки как описано в 8.3.1.

8.3.3 Повторяют этап экстракции витамина Е по 8.3.2.

8.3.4 Объединенные экстракты петролейного эфира промывают четырьмя порциями по 100 см3 дистиллированной воды, сначала немного наклоняя двлитвльнуюеоронку из стороны в сторону, потом слегка встряхивая, чтобы свести к минимуму образование эмульсии.

8.3.5 Промытый экстракт через воронку для фильтрования (см. 5.14), заправленную фильтро-вальной бумагой средней/быстрой фильтрации (си. 5.15) со слови 30 г безводного сернокислого натрия (см. 4.8). переносят в круглодонную колбу для вакуумного выпаривания по ГОСТ 15336 (см. 5.16).

Делительную воронку споласкивают двумя порциями по 20 си3 петролейного эфира и добавляют их через фильтр в колбу для выпаривания.

Промывают фильтреще двумя порциями по 25 см3 петролейного эфира и собирают смывы в колбу для выпаривания.

8.3.6 Петролейный эфир выпаривают из экстракта досуха на роторном испарителе (см. 5.4) под вакуумом при температуре не выше 40 *С.

Необходимо следить за тем. чтобы колбу извлекли из роторного испарителя немедленно после достижения точки высыхания, так как продолжительное высушивание может привести к потере витамина Е.

Если концентрация витамина Е в экстракте петролейного эфира достаточно высока, экстракт можно довести до фиксированного объема петролейным эфиром и аликвотную часть взять для выпаривания. Атмосферное давление восстанавливают с помощью инертного газа (см. 4.10).

Примечание — Нумерация пунктов введена с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний.

8.4 Определение

8.4.1 Остаток (см. 8.3.6) растворяютв минимальном объеме гексана (см. 4.4) и переносят количественно в мерную колбу вместимостью 25 си3 (см. 5.17).

Колбу для выпаривания споласкивают тремя небольшими порциями гексана, перенося смывы в ту же мерную колбу. Доводят объем содержимого колбы до метки гексаном и перемешивают.

При необходимости экстракт пробы фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.5) или центрифугируют.

8.4.2 вводят 20 им3 экстракта пробы в колонку жидкостного хроматографа (см. 5.1) и измеряют площадь пика OL-a-токоферола.

Предлагаются следующие условия ВЭЖХ:

• колонкадляжидкостнойхроматографии(см.5.1.3)размедом250 х 4.6мм.набивка — кремнезем с размером частиц от 5 до Юмкм или равноценная;

• подвижная фаза (см. 4.11): смесь гексана (см. 4.4) и 1.4-диоксана (см. 4.7) в соотношении 970:30 по объему,

• скорость потока: 1.5см3/мин;

• детектор флуоресценции (см. 5.1.4){еоэбуждение придлимеволмы295нм. испускание при длине волны 330 нм).

Допускается использовать другие условия, если они дают равноценный результат.

Также можно использовать хроматографию обратными фазами при условии, что эффективность колонки достаточна, чтобы отделить DL-a-токоферол от других токоферолов и совместно экстрагируемых с витамином Е веществ из пробы. Если используют хроматографию обратными фазами, растворы пробы и стандартного образца необходимо разбавить подходящим растворителем, например, метиловым спиртом (см. 4.13).

8.4.3 Рассчитывают среднюю площадь лика по повторным вводам экстракта пробы и определяют концентрацию DL-a-токоферола в экстракте:

а) либо по ссылке на среднюю площадь лика, полученного при повторных вводах раствора стандартного образца DL-a-токоферола массовой концентрации в пределах 5 % от концентрации в экстракте пробы.

б) либо по ссылке на градуировочную кривую, построенную по 8.5.

8.5 Градуировка

8.5.1 Приготовление градуировочных растворов стандартного образца DL-u-токоферола

8.5.1.1 Исходный раствор стандартного образца DL-a-токоферола

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (10010.1) мг DL-u-токоферола (см. 4,6) и растворяют гексаном (см. 4.4), доводя объем в колбе до метки. Исходный стандартный раствор устойчив в течение 1 недели. еслихранитьвгопритемпвратуренввыше4 *Се герметично закрытой колбеиз янтарного стекла.

8.5.1.2 Рабочий стандартный раствор DL-a-токоферола: одноточечная градуировка

Готовят рабочий стандартный раствор путем разбавления исходного стандартного раствора (см. 8.5.1.1) гексаном, чтобы получить массовую концентрацию, приблизительно равную ожидаемой в экстракте пробы. Альтернативно переходят к8.5.1.3.

8.5.1.3 Рабочий стандартный раствор DL-a-токофэрола: многоточечная градуировка

Готовят ряд градуировочных стандартных растворов в диапазоне массовых концентраций 2.4.6.8 и Юмкг/см3 DL-a-токоферола путем разбавления исходного стандартного раствора (см. 8.5.1.1) гексаном.

Рабочие стандартные раапворы готовят в день проведения испытания.

8.5.2 УФ-лроверка стандартного образца DL-u-токоферола

(10010,1) мг DL-a-токоферола (см. 4.6) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте (см. 4.12). Доводят объем до метки тем же растворителем и перемешивают.

Разбавляют 2,0 см3этого раствора в мерной колбе вместимостью25.0 см3этиловым спиртом (см. 4.12). Доводят объем до метки и измеряют УФ-спектр полученного раствора против этилового спирта (см. 4.12)на спектрометре (см. 5.7) лридлине волны от 250 до320 нм. максимальное лог лощение должно происходить лридлине волны 292 нм:

Е ^ = 75.8 при длине волны 292 нм в этиловом спирте.

При таком разбавлении коэффициент ослабления должен получаться равным 0.6.

9 Обработка результатов

Содержание витамина Е в анализируемой пробе IV£. МЕ/кг. вычисляют по формуле

щ.25-8-”.

где 25 — коэффициент пересчета;

с — массовая концентрация DL-a-токоферола в экстракте, мкг/см3; 1.1— поправочный коэффициент для ацетата DL-a-токоферола; m — масса анализируемой пробы по 8.2, г.

10 Прецизионность

10.1 Межлабораторные испытания

Результаты межлабораторных испытаний в отношении прецизионности метода определения содержания витамина Е в кормах приведены в приложении А. Значения, полученные в этих испытаниях, не могут быть применимы к диапазонам концентраций и образцам, отличающимся от описанных в данном стандарте

10.2 Повторяемость (сходимость)

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных независимых испытаний, полученными одним и тем же методом, на одной испытуемой пробе, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, на одном и том же оборудовании, в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости, г. приведенный в таблице 1. более чем в 5 % случаев.

10.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом, на одной испытуемой пробе, в разных лабораториях, разными операторами, на различном оборудовании, не должно превышать предел воспроизводимости R. приведенный в таблице 1. более чем в 5 % случаев.

Таблица 1— Пределы повторяемости (г) и воспроизводимости (ft)

Наименование анализируемой пробы	Содержание витамина Е. ME.’«г	Предел повторяемости г. ME/U	Предел воспроизводимости А. МЕ/кг
Коры для крупного рогатого скота	23.1	1.36	3.51
Корм для птицы	29.7	2.07	10.02
Корм для свиней	64.9	4.06	17.44
Корм для животных А* (рацион 722)	78.0	4.94	18.31
Корм для животных В’ (рацион 748)	140.6	15.73	43.91
Консервированный корм для домашних питомцев	20.6	0.98	7.46
влажный корм для домашних литомцеа	180.4	15.23	29.70
Сухой корм для домашних питомцев	78.7	4.22	16.97
* Рассчитано на абсолютно сухое вещество.

11 Протокол испытания

Протокол испытания должен включать следующее:

• всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

• используемый метод отбора проб, если известен;

• используемый метод определения оо ссылкой на настоящий стандарт;

• все детали испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несу* щественные, которые могли повлиять на реэультат(ы) испытания;

• полученный результат испытания или среднеарифметическое значение результатов двух испытаний, если проверена повторяемость.

Приложение А (справочное)

Результаты межлабораторных испытаний

Прецизионность метода была установлена с ходе мвжлабораторных испытаний, выполненных в соответствии с (1). (2). Результаты этих испытаний опубликованы в/З). В испытаниях приняло участие 10—12 лабораторий. Были исследованы следующие пробы: кори для крупного рогатого скота — f. корм для птицы — 2. корм для свиней — 3. корм для животных А (рацион 722) — 4’, корм для животных в (рацион 748) — 5*. консервированный корм для домашних питомцев — 8. влажный корм для домашних питомцев — 7.сухой корм для домашних питомцев — 8.

Статистические результаты межлвборе/порных испытаний приведены а таблице А.1.

Таблица А.1— Статистические результаты межлабораторных испытаний

Наименование показателя	Значение показателя для проб
Наименование показателя	1	2	3	4’	S’	6	7	8
Количество лабораторий	10	10	10	12	12	11	11	11
Количество отдельных результатов	20	20	20	24	24	22	22	22
Количество принятых результатов	14	16	16	18	18	14	14	14
Среднее значение содержания витамина Е. МЕ/кг	23.11	29.66	64.94	78.03	140.63	20.55	180.39	78.66
Стандартное отклонение повторяемости, в/. МЕ/кг	0,44	0.69	1.35	1.66	5.27	0.32	4.98	1.36
Коэффициент вариации повторяемости. Ч	1.92	2.32	2.07	2.12	3.75	1.56	2.76	1.76
Предел повторяемости, г (г* 2,6 а,). МЕ/кг	1.36	2.07	4.06	4.94	15.73	0.98	15.23	4.22
Стандартное отклонение воспроизводимости. Sr. МЕ/кг	1.15	3.33	5.79	6.13	14.72	2.44	9.72	5.55
Коэффициент вариации воспроизводимости. %	4.97	11.21	8.91	7.86	10.46	11.89	5.39	7.06
Предел воспроизводимости, г (г* 2,6 Sr). МЕ/кг	3.51	10.02	17.44	18.31	43.91	7.46	29.70	16.97

• Рассчитано на абсолютно сухое вещество.

Приложение ДА (справочное)

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного

международного стандарта

Таблице ДА.1

Структура настоящего стандарта			Структура международного стандарта
Подрайон	Пункт	Подпункт	Подраздел	Пункт	Подпункт
Раздел 5			Раздел 5
5.1	5.1.1	—	5.1	S.1.1	—
—	5.1.2	—	—	5.1.2	—
—	5.1.3	—	—	5.1.3	—
—	5.1.4	—	—	5.1.4	—
5.2	—	—	5.2	—	—
5.3	—	—	5.3	—	—
5.4	5.4.1	—	5.4	—	—
—	5.4.2	—	—	—	—
—	5.4.3	—	—	—	—
5.S	—	—	S.5	—	—
5.6	—	—	5.6	—	—
5.7	—	—	5.7	—	—
5.8	—	—	—	—	—
5.9	—	—	—	—	—
5.10	—	—	—	—	—
5.11	—	—	—	—	—
5.12	—	—	—	—	—
5.13	—	—	—	—	—
5.14	—	—	—	—	—
5.15	—	—	—	—	—
5.16	—	—	—	—	—
5.17	—	—	—	—	—
5.18	—	—	—	—	—
5.19	—	—	—	—	—
Раздел 8			Раздел 8
8.1	—	—	8.1	—	—
8.2	—	—	8.2	—	—
8.3	8.3.1	—	8.3	—	—
—	8.3.2	—	—	—	—
—	8.3.3	—	—	—	—
—	8.3.4	—	—	—	—
—	8.3.5	—	—	—	—
—	8.3.6	—	—	—	—

Окончание таблицы ДА. 1

Структура настоящего стандарта			Структура ыеждународкото стандарта
Подраздел	Пункт	Подпункт	Подраздел	Пункт	Подпункт
8.4	8.4.1	—	8.4	8.4.1	—
—	8.4.2	—	—	8.4.2	—
—	8.4.3	—	—	8.4.3	—
8.5	8.5.1	8.5.1.1	8.5	8.5.1	8.5.1.1
—	—	8.S.1.2	—	—	8.5.1.2
—	—	8.5.1.3	—	—	8.5.1.3
—	8.5.2	—	—	8.5.2	—
Приложение ДА (справочное) Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта			—
Примечания 1 Сопоставление структуры стандартов приведено, начиная с раздела 5. так как предыдущие разделы стандартов и их иные структурные злементы (за исключением предисловия) идентичны. 2 В разделе 5 (подраздел 5.4) настоящего стандарта введена нумерация пунктов 5.4.1— 5.4.3 для использования ссылок на них по тексту. 3 В раздел 5 настоящего стандарта добавлены подразделы 5.5— 5.19 с учетом требований к дополнительному оборудованию, используемому в России. 4 в разделе 8 (подраздел 8.3) нестоящего стандарта, введена нумерация пунктов 8.3.1—8.3.6 с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний. 5 В соответствии с ГОСТ 1.7—2008 в настоящий стандарт включено дополнительное приложение ДА «Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта».

Библиография

(1} ИСО 5725*1:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 1. Общие принципы и определения

12} ИСО 5725*2:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Честь 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения

(3} Analytical Methods Committee. Analyst. 116,191. pp. 421—430

УДК 636.085.3:006.354 ОКС65.120 С19 ОКСТУ9209

Ключевые слова: корма для животных, витамин Е (DL-a-токофврол), содержание, сущность метода, вы» сокоэффективная жидкостная хроматография, омыление, экстракция, летролейный эфир, гексан, эти» ловый спирт, прямая фаэа. проведение испытания, обработка результатов, прецизионность, протокол испытания

Редактор М.Е. Никулина Технический редактор в. Н. Прусакова Корректор 6.И. варамцоаа Компьютерная верстка А Н. Золотаревой

Сданоанабор 04.06.2014. Подписано а печать 27.08.2014. Формат 60 - 84Гарнитура Ариел. Уел. печ. л. 1.66. Уч.-иад. л. 1,30. Тираж 86 эха За». 3611.

Издано и отпечатано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123985 Москва. Гранатный лер.. 4. www.90slinfo.1u

allgosts.ru

ГОСТ Р 54950-2012 Корма для животных. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Корма для животных. Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

НАЦИОНАЛЬНЫМ

СТАНДАРТ

РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

ГОСТР 54950—

2012 (ИСО 14565:2000)

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ISO 14565:2000

Animal feeding stuffs — Determination of vitamin A content — Method using high-performance liquid chromatography (MOD)

Издание официальное

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП») на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 004 «Комбикорма, белково-витаминно-минеральные концентраты, премиксы»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 июля 2012 г. № 212-ст

4 Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 14565:2000 «Корма для животных. Определение содержания витамина А. Метод с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии» (ISO 14565:2000 «Animal feeding stuffs— Determination of vitamin A content — Method using high-performance liquid chromatography») путем изменения отдельных фраз, слов, наименований единиц измерения, ссылок, которые в тексте стандарта выделены курсивом. При этом потребности национальной экономики Российской Федерации и особенности Российской национальной стандартизации учтены в дополнительных подразделах 6.7—6.21, которые выделены путем заключения их в рамки из тонких линий, а информация с объяснением включения этих положений приведена в виде примечаний.

Структура национального стандарта соответствует структуре международного стандарта, за исключением подразделов 6.5 и 9.3, которые разбиты на пункты для использования ссылок на описание прибора и повторяющиеся этапы испытаний, раздел 2 дополнен ссылками на национальные и межгосударственные стандарты для приведения в соответствие с правилами, установленными в ГОСТ 1.5 (подразделы 4.2 и 4.3), и сведениями о соответствии ссылочных национальных и межгосударственных стандартов международным стандартам, использованным в качестве ссылочных в примененном международном стандарте.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с правилами, установленными ГОСТ Р 1.5 (подраздел 3.5), ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на

1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок—в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

Содержание

1 Область применения............................................1

2 Нормативные ссылки............................................1

3 Термины и определения..........................................2

4 Сущность метода.............................................2

5 Реактивы..................................................2

6 Средства измерений, оборудование и материалы...........................2

7 Отбор проб.................................................4

8 Подготовка проб для испытания.....................................4

9 Проведение испытания..........................................4

10 Обработка результатов..........................................7

11 Прецизионность..............................................7

12 Протокол испытания...........................................8

Приложение А (справочное) Результаты межлабораторных испытаний.................9

Приложение ДА (справочное) Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой

примененного международного стандарта......................10

Библиография................................................11

ГОСТ Р 54950-2012 (ИСО 14565:2000)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Animal feeding stuffs. Determination of vitamin A content by high-performance liquid chromatography method

Дата введения — 2013—07—01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма для животных и устанавливает метод определения содержания витамина А (ретинола) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты: ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498—98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб (ИСО 6498:1998, MOD)

ГОСТ Р 51568-99 (ИСО 3310-1—90) Сита лабораторные из металлической проволочной сетки. Технические условия

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435—73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 29251-91 (ИСО 385-1—84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпус-

Издание официальное

кам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание витамина А: Содержание всех изомеров ретинола, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах на килограмм (МЕ/кг).

Примечание — 1 МЕ витамина А соответствует 0,300 мкг изомеров ретинола.

4 Сущность метода

Сущность метода заключается в омылении анализируемой пробы водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витамина А петролейным эфиром, выпаривании петролейного эфира и растворении полученного остатка в 2-пропаноле. Содержание витамина А в 2-пропаноловом экстракте определяют с помощью ВЭЖХ обратными фазами, используя условия, в которых получается один пик для всех изомеров ретинола.

5 Реактивы

5.1 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

5.2 Калия гидроокись (КОН) по ГОСТ 24363, раствор с массовой долей 50 %

500 г гидроокиси калия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3 (см. 6.17), растворяют в дистиллированной воде (см. 5.1) и доводят объем раствора водой до метки.

5.3 Спирт этиловый ректификованный (С2Н5ОН) по ГОСТ Р 51652 с объемной долей 95 % или эквивалентный технический метилированный спирт.

5.4 2-пропанол (С3Н7ОН).

5.5 Эфир петролейный, интервал температуры кипения от 40 °С до 60 °С. Остаток после выпаривания должен быть не более 20 мг/дм3.

5.6 Стандартный образец витамина А (ретинил-ацетата)

5.6.1 Ретинил-ацетат, ацетат витамина А (С22Н32О2) молярной массой 328,5 г/моль, чистота не менее 90 %.

5.6.2 Ретинол, витамин А спирт (С20Н30О) молярной массой 286,5 г/моль, чистота не менее 90 %.

5.7 Спирт метиловый (СН3ОН) специальной марки для ВЭЖХ.

5.8 Подвижная фаза для жидкостной хроматографии

Смешивают метиловый спирт (см. 5.7) и дистиллированную воду (см. 5.1) в соотношении 770:30 по объему и при необходимости фильтруют через мембранный фильтр (см. 6.6).

5.9 Натрий сернокислый (№2SO4) по ГОСТ 4166, безводный.

5.10 Натрия аскорбат, раствор массовой концентрации с =100 г/дм3.

5.11 Инертный газ, например, азот по ГОСТ 9293.

Примечание — Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

6 Средства измерений, оборудование и материалы

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее:

6.1 Высокоэффективный жидкостный хроматограф, состоящий из следующего оборудования:

6.1.1 Насос, установленный для подачи элюента с постоянной объемной скоростью 1 см3/мин.

6.1.2 Устройство для ввода ВЭЖХ.

6.1.3 Колонка длиной 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, набивная, неподвижная фаза состоит из октадециловых групп (С18), присоединенных к кремнезему.

Колонка считается удовлетворительной, если число теоретических тарелок не менее 4000, значение коэффициента емкости к' равно 0,6 в отношении изомеров ретинола. Рекомендуемый размер частиц от 5 до 10 мкм.

Допускается использовать другие системы при условии, что достигается удовлетворительное отделение витамина А от других экстрагируемых с ним веществ.

6.1.4 Детектор, позволяющий производить измерение ультрафиолетового (УФ) излучения при длине волны 325 нм и оснащенный интегратором (системой обработки данных).

6.2 Спектрометр в УФ области спектра (или в УФ-видимой области спектра), обеспечивающий измерение поглощения при длине волны, определенной в 9.6, оснащенный кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 10 мм.

6.3 Баня с кипящей водой.

6.4 Испаритель роторный вакуумный с водяной баней при температуре 40 °С.

6.5 Аппарат для экстракции (см. рисунок 1), состоящий из следующего:

1 — цилиндр со шлифом вместимостью 1000 см3; 2 — слой петролейного эфира; 3 — водный слой с омыленной пробой корма; 4 — насадка, обеспечивающая притертое соединение с цилиндром;

5 — отводная трубка; 6 — трубка сифонная регулируемая

Рисунок 1 — Пример аппарата для экстракции

6.5.1 Цилиндр для экстракции вместимостью 1000 см3 со шлифом по ГОСТ 1770 и притертой пробкой.

6.5.2 Насадка, имеющая отводную трубку, обеспечивающая притертое соединение с цилиндром, оснащенная регулируемой сифонной трубкой (см. 6.5.3), проходящей по центру.

6.5.3 Трубка сифонная регулируемая с нижним концом U-образной формы для переноса верхнего слоя жидкости из цилиндра в делительную воронку вместимостью 1000 см3.

Допускается использовать другое оборудование для экстракции, такое как конические колбы и делительные воронки вместо аппарата, показанного на рисунке 1, при условии, что достигается удовлетворительный выход витамина А.

6.6 Мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы (см. 5.8) и растворов проб для испытания.

6.7 Мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода через сито с размером отверстий 1,0 мм.

6.8 Сито с размером стороны квадратных ячеек 1,0 мм по ГОСТ Р 51568.

6.9 Мясорубка с размером отверстий в пластинке 4,0 мм.

6.10 Весы лабораторные по ГОСТ Р 53228 с наибольшим пределом взвешивания 500 г и допускаемой погрешностью однократного взвешивания ± 0,001г.

6.11 Колбы конические Кн-2-1000-42 ТХС по ГОСТ 25336.

6.12 Холодильники стеклянные лабораторные обратимые по ГОСТ 25336.

6.13 Воронки делительные ВД -1(2)-1000 ХС по ГОСТ 25336.

6.14 Воронки фильтрующие ВФ-1(3)-100 ХС по ГОСТ 25336.

6.15 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры.

6.16 Колбы круглодонные К-2-250-34 ТХС по ГОСТ 25336.

6.17 Колбы мерные 1(2)-50(250, 1000)-2 по ГОСТ 1770.

6.18 Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-1-1(2, 5) по ГОСТ 29227.

6.19 Бюретки вместимостью 5 см3 по ГОСТ 29251.

6.20 Цилиндры мерные 1(2)-50(100, 250, 1000) по ГОСТ 1770.

6.21 Колбы мерные вместимостью 20 см3.

Примечание — Подразделы 6.7—6.21 введены дополнительно с учетом требований к перечню оборудования, необходимого для проведения испытания и применяемого в Российской Федерации.

7 Отбор проб

Отбор проб — по ГОСТ 13496.0.

Пробу должны хранить в условиях, предотвращающих ее порчу или изменение состава.

8 Подготовка проб для испытания

Пробу для испытания готовят в соответствии с ГОСТ Р 51419.

Непосредственно перед началом испытаний лабораторную пробу тщательно перемешивают и измельчают на лабораторной мельнице (см. 6.7) до прохода через сито с отверстиями 1,0 мм (см. 6.8). Снова тщательно перемешивают.

Консервированные и влажные корма гомогенизируют, для чего лабораторную пробу пропускают через мясорубку с диаметром отверстий в пластинке 4,0 мм (см. 6.9) и тщательно перемешивают.

9 Проведение испытания

9.1 Общие положения

Ввиду чувствительности витамина А кУФ-излучению и воздуху все операции выполняют в местах, защищенных от сильного естественного и люминесцентного освещения, и по возможности быстро и аккуратно. Рекомендуется использовать янтарное стекло.

Каждое испытание должно проводиться в течение одного рабочего дня.

Омыление и экстракцию стандартного образца ретинил-ацетата и анализируемых проб выполняют одновременно.

9.2 Омыление

На лабораторных весах (см. 6.10) взвешивают (50 ± 0,1) г пробы, подготовленной по 8, и помещают в коническую колбу вместимостью 1000 см3 (см. 6.11).

К анализируемой пробе добавляют при помощи цилиндра (см. 6.20) 200 см3 этилового спирта (см. 5.3) и помешивают колбу круговыми движениями, чтобы проба диспергировала.

В коническую колбу с анализируемой пробой добавляют 2 см3 раствора аскорбата натрия (см. 5.10), 50 см3 раствора гидроокиси калия (см. 5.2) и снова помешивают колбу круговыми движениями. Подсоединяют к колбе обратимый холодильник (см. 6.12) и погружают колбу в кипящую водяную баню (см. 6.3).

Колбу с содержимым и обратимым холодильником выдерживают на кипящей бане в течение 60 мин, время от времени помешивая круговыми движениями.

Колбу извлекают из бани и охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды как можно быстрее.

9.3 Экстракция витамина А (ретинола)

9.3.1 Содержимое колбы переносят в цилиндр для экстракции (см. 6.5.1), ополаскивают колбу для омыления двумя порциями по 25 см3 этилового спирта или технического метилированного спирта (см. 5.3) и переносят их в цилиндр.

Повторяют ополаскивание колбы двумя порциями по 125 см3 петролейного эфира (см. 5.5) и одной порцией 250 см3 дистиллированной воды (см. 5.1), каждый раз перенося ополаскивающие порции в цилиндр. Закрывают цилиндр пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин, время от времени сбрасывая давление.

Охлаждают цилиндр под струей холодной воды.

После разделения двух жидких фаз пробку вынимают, смывают боковые стороны пробки небольшим количеством петролейного эфира и вставляют в цилиндр насадку (см. 6.5.2) с регулируемой сифонной трубкой (см. 6.5.3), располагая нижний открытый конец трубки таким образом, чтобы он располагался прямо над уровнем границы разделения двух фаз.

Путем приложения через отводную трубку небольшого давления с помощью инертного газа (см. 5.11) переносят верхний слой петролейного эфира в делительную воронку вместимостью 1000 см3 (см. 6.13).

9.3.2 В цилиндр для экстракции добавляют 125 см3 петролейного эфира, закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 1 мин. Дают слоям разделиться и переносят верхний слой в ту же делительную воронку с помощью регулируемой трубки как описано в 9.3.1.

9.3.3 Повторяют этап экстракции витамина А по 9.3.2.

9.3.4 Объединенные экстракты петролейного эфира промывают четырьмя порциями по 100 см3 дистиллированной воды, сначала немного наклоняя делительную воронку из стороны в сторону, потом слегка встряхивая, чтобы свести к минимуму образование эмульсии.

9.3.5 Промытый экстракт через воронку для фильтрования (см. 6.14), заправленную фильтровальной бумагой средней или быстрой фильтрации (см. 6.15) со слоем 60 г безводного сернокислого натрия (см. 5.9), переносят в круглодонную колбу (см. 6.16), подходящую для вакуумного выпаривания.

Делительную воронку споласкивают двумя порциями по 20 см3 петролейного эфира и добавляют их через фильтр в колбу для выпаривания.

Промывают фильтр еще двумя порциями по 25 см3 петролейного эфира и добавляют их в колбу для выпаривания.

9.3.6 Петролейный эфир выпаривают из экстракта досуха на роторном испарителе (см. 6.4) под вакуумом при температуре не выше 40 °С. Атмосферное давление восстанавливают с помощью инертного газа (см. 5.11).

Примечание — Нумерация пунктов введена с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний.

9.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография

9.4.1 Остаток (см. 9.3.6) растворяют в минимальном объеме 2-пропанола (см. 5.4) и переносят количественно в мерную колбу вместимостью 20 см3 (см. 6.21).

Колбу для выпаривания ополаскивают тремя небольшими порциями 2-пропанола, перенося смывы в ту же мерную колбу. Доводят объем содержимого колбы до метки 2-пропанолом и перемешивают.

Для кормов, содержащих витамина А более 100000 МЕ/кг, рекомендуется дальнейшее разведение.

При необходимости экстракт пробы фильтруют через мембранный фильтр (см. 6.6).

9.4.2 При невозможности проведения испытания в течение одного дня экстракт хранят в атмосфере инертного газа (см. 5.11) в холодильнике при температуре 4 °С, а затем выдерживают в темном месте до достижения комнатной температуры.

9.4.3 Вводят 10 мм3 экстракта пробы в колонку жидкостного хроматографа (см. 6.1) и измеряют площадь пика ретинола.

9.4.4 Рассчитывают среднюю площадь пика по повторным вводам экстракта пробы и определяют концентрацию ретинола в экстракте со ссылкой на среднюю площадь пика, полученного при повторных вводах стандартного раствора ретинола аналогичной концентрации. Время удерживания ретинола составляет около 5 мин. Выполняют ввод порций экстракта пробы и стандартного раствора по очереди.

9.5 Гидролиз ретинил-ацетата для градуировки

Готовят раствор ретинил-ацетата (см. 5.6) в этиловом спирте (см. 5.3) так, чтобы 1 см3 раствора содержал приблизительно 15000 МЕ витамина А.

Примечание — 1 МЕ витамина А равноценна 0,344 мкг ретинил-ацетата.

Используя бюретку на 5 см3 с ценой деления 0,02 см3 (см. 6.19), переносят (2,5 + 0,02) см3 этого раствора в колбу вместимостью 250 см3. Добавляют 20 см3 этилового спирта, 1 см3 раствора гидроокиси калия (см. 5.2) и 5 см3 раствора аскорбата натрия (см. 5.10).

К колбе присоединяют обратимый холодильник, погружают ее в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 60 мин. Охлаждают колбу до комнатной температуры под струей холодной воды и переносят содержимое в делительную воронку (см. 6.13).

Ополаскивают колбу порцией 50 см3 дистиллированной воды, затем порцией 25 см3 этилового спирта и добавляют смывы в делительную воронку. Экстрагируют витамин А из водно-спиртовой фазы одной порцией 80 см3 петролейного эфира, затем еще двумя порциями петролейного эфира по 50 см3.

Объединяют экстракты петролейного эфира, затем смывают двумя порциями дистиллированной воды по 50 см3. Добавляют (2 + 0,1) г безводного сернокислого натрия (см. 5.9).

Количественно переносят экстракт петролейного эфира в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят объем петролейным эфиром до метки.

Концентрация ретинола в этом растворе (раствор 1) равна 150 МЕ/см3.

9.6 Стандартизация раствора ретинола для градуировки

Пипеткой (см. 6.18) переносят (5 + 0,03) см3 раствора 1 (см. 9.5) в мерную колбу вместимостью 50 см3 и удаляют растворитель при температуре окружающей среды струей инертного газа (см. 5.11).

Растворяют остаток в 2-пропаноле и доводят объем 2-пропанолом до метки.

Измеряют поглощение (А) раствора, используя 2-пропанол в качестве контроля, при длине волны 310, 325 и 334 нм. Значения поглощения будут приблизительно 0,7—0,8. При необходимости допускается использовать промежуточное разведение.

Скорректированное поглощение при длине волны 325 нм, (А325 корр), вычисляют по формуле

А325, корр = 6,815 ■ А325 - 2,555 ■ А310 - 4,26 • А334, (1)

если

A325-корр <0,97, (2)

корр

то для стандартизации используют значение А325 корр; в противном случае используют А325.

Концентрацию ретинола в растворе 1, с, МЕ/см3, вычисляют по формуле

с = А325 ■ 183 МЕ/см3 (3)

или

с = А325, орр ■ 183 МЕ/см3. (4)

9.7 Приготовление стандартного образца ретинола для хроматографии

Готовят раствор ретинола в 2-пропаноле (см. 5.4) приблизительно такой же концентрации, как ожидается в экстракте (см. 9.4.1). На каждые 1000 МЕ витамина А на килограмм пробы в экстракте ожидается концентрация ретинола 2,5 МЕ/см3.

Выпаривают аликвотный объем раствора 1 (см. 9.5) досуха при окружающей температуре в потоке инертного газа (см. 5.11). Растворяют остаток в подходящем объеме 2-пропанола, чтобы обеспечить требуемую концентрацию ретинола, и перемешивают. При необходимости фильтруют стандартный раствор через мембранный фильтр (см. 6.6).

Допускается для градуировки использовать стандартный раствор витамина А (ретинола) в 2-пропаноле, приготовленный путем разбавления исходного стандартного раствора ретинола, полученного при растворении соответствующего количества стандартного образца ретинола (см. 5.6.2) непосредственно в 2-пропаноле.

В этом случае проверяют стандартный раствор витамина А путем измерения его поглощения в кварцевых кюветах (см. 6.2) при длине волны 300, 325, 350 и 370 нм, используя 2-пропанол в качестве контроля. Определяют отношение А/А325 при каждой длине волны для ретинола, если полученное отношение не превышает 0,602; 0,432 и 0,093 при 300, 350 и 370 нм соответственно, стандартный образец подходит для применения [1], [2].

Примечание — Использование многоточечной градуировки рекомендуется в тех случаях, когда ожидаемая концентрация витамина А в экстракте пробы неизвестна.

10 Обработка результатов

Содержание витамина А в анализируемой пробе, Wk, МЕ/кг, вычисляют по формуле

WA = 20000 —, (5)

где 20000 — коэффициент пересчета;

с — концентрация ретинола в экстракте, МЕ/см3; m — масса анализируемой пробы по 9.2, г.

11 Прецизионность

11.1 Межлабораторные испытания

Результаты межлабораторных испытаний в отношении прецизионности метода определения содержания витамина А в кормах приведены в приложении А. Значения, полученные в этих испытаниях, не могут быть применимы к диапазонам концентраций и образцам, отличающимся от описанных в данном стандарте.

11.2 Повторяемость (сходимость)

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных независимых испытаний, полученными одним и тем же методом, на одной испытуемой пробе, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, на одном и том же оборудовании, в течение короткого промежутка времени, не должно превышать предел повторяемости, г, приведенный в таблице 1, более чем в 5 % случаев.

11.3 Воспроизводимость

Абсолютное расхождение между результатами двух отдельных испытаний, полученными одним и тем же методом, на одной испытуемой пробе, в разных лабораториях, разными операторами, на различном оборудовании, не должно превышать предел воспроизводимости R, приведенный в таблице 1, более чем в 5 % случаев.

Таблица 1 — Пределы повторяемости (г) и воспроизводимости (R)

Наименование анализируемой пробы	Содержание витамина А, МЕ/кг	Предел повторяемости г, МЕ/кг	Предел воспроизводимости R, МЕ/кг
Гранулированный корм для птицы	9888	860	2068
Корм для крупного рогатого скота	10812	2099	3549
Корм для рыбок	15879	2800	4672
Влажный корм для домашних животных	33250	1536	2446
Комбикорм-концентрат для свиней	40661	4049	7941

12 Протокол испытания

Протокол испытания должен включать в себя следующее:

- всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;

- используемый метод отбора проб, если известен;

- используемый метод определения со ссылкой на настоящий стандарт;

- все детали испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;

- полученный результат испытания, или среднеарифметическое значение результатов двух испытаний, если проверена повторяемость.

Приложение А (справочное)

Результаты межлабораторных испытаний

Прецизионность метода была установлена в ходе межлабораторных испытаний, выполненных в соответствии с [3], [4]. Результаты этих испытаний опубликованы в [5]. В испытаниях приняло участие 12—14 лабораторий. Были исследованы следующие пробы: влажный корм для домашних животных —1, гранулированный корм для птицы — 2, корм для крупного рогатого скота — 3, комбикорм-концентрат для свиней — 4, корм для рыбок — 5. Статистические результаты межлабораторных испытаний приведены в таблице А.1.

Таблица А.1 — Статистические результаты межлабораторных испытаний

Наименование показателя	Значение показателя для проб:
Наименование показателя	1	2	3	4	5
Число лабораторий	14	12	13	12	13
Число отдельных результатов	56	24	26	24	26
Число принятых результатов	56	24	26	24	26
Среднее значение содержания витамина А, МЕ/кг	33250	9888	10812	40661	15879
Стандартное отклонение повторяемости sr, МЕ/кг	668	304	742	1431	989
Коэффициент вариации повторяемости, %	2,0	3,1	6,9	3,5	6,2
Предел повторяемости r (r = 2,8 ■ sr), МЕ/кг	1536	860	2099	4049	2800
Стандартное отклонение воспроизводимости SR, МЕ/кг	864	731	1254	2806	1651
Коэффициент вариации воспроизводимости, %	2,6	7,4	11,6	6,9	10,4
Предел воспроизводимости, R (R = 2,8 ■ SR), МЕ/кг	2446	2068	3549	7941	4672

Приложение ДА (справочное)

Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта

Таблица ДА.1

Структура настоящего стандарта			Структура международного стандарта
Подраздел	Пункт	Подпункт	Подраздел	Пункт	Подпункт
Раздел 6			Раздел 6
6.1	6.1.1	—	6.1	6.1.1	—
—	6.1.2	—	—	6.1.2	—
—	6.1.3	—	—	6.1.3	—
—	6.1.4	—	—	6.1.4	—
6.2	—	—	6.2	—	—
6.3	—	—	6.3	—	—
6.4	—	—	6.4	—	—
6.5	6.5.1	—	6.5	—	—
—	6.5.2	—	—	—	—
—	6.5.3	—	—	—	—
6.6	—	—	6.6	—	—
Раздел 9			Раздел 9
9.1	—	—	9.1	—	—
9.2	—	—	9.2	—	—
9.3	9.3.1	—	9.3	—	—
—	9.3.2	—	—	—	—
—	9.3.3	—	—	—	—
—	9.3.4	—	—	—	—
—	9.3.5	—	—	—	—
—	9.3.6	—	—	—	—
Приложение ДА Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта			—
Примечания 1 Сопоставление структуры стандартов приведено, начиная с раздела 6, так как предыдущие разделы стандартов и их иные структурные элементы (за исключением предисловия) идентичны. 2 В разделе 6 подразделе 6.5 настоящего стандарта введена нумерация пунктов 6.5.1—6.5.3 для использования ссылок на них по тексту. 3 В разделе 9 подразделе 9.3 настоящего стандарта введена нумерация пунктов 9.3.1—9.3.6 с целью использования ссылок на повторяющиеся этапы испытаний. 4 В соответствии с ГОСТ 1.7-2008 в настоящий стандарт включено дополнительное приложение ДА «Сопоставление структуры настоящего стандарта со структурой примененного международного стандарта».

Библиография

[1] Takashima, Y. et al. Stability of retinol analogs. Chem. Pharm. Bull., 27, 1979, pp. 1553

[2] Bolliger, M.R. et al. The monograph of vitamin A in the European Pharmacopoeia. Pharm. Acta. Helv., 52 (8), 1977, pp. 161—174

[3] ИСО 5725-1:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 1. Общие принципы и определения

[4] ИСО 5725-2:1994 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерения. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерения

[5] Analytical Methods Committee, Analyst, 110, 1985, pp. 1019—1026

УДК 636.085.3:006.354 ОКС 65.120 С19 ОКСТУ 9209

Ключевые слова: корма для животных, витамин А, ретинол, ретинил-ацетат, сущность метода, высокоэффективная жидкостная хроматография, омыление, экстракция, петролейный эфир, обратная фаза, проведение испытаний, обработка результатов, прецизионность, протокол испытания

Редактор М.Е. Никулина Технический редактор В.Н. Прусакова Корректор М.М. Малахова Компьютерная верстка В.И. Грищенко

Сдано в набор 02.10.2013. Подписано в печать 15.10.2013. Формат 60х841/8. Гарнитура Ариал. Усп. печ. л. 1,86.

Уч.-изд. л. 1,25. Тираж 153экз. Зак. 1152.

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. [email protected] Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.

Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.

standartgost.ru

ГОСТ 27547-87 Витамин Е (альфа-токоферола ацетат) микрогранулированный кормовой. Технические условия

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВИТАМИН Е (α-ТОКОФЕРОЛА АЦЕТАТ) МИКРОГРАНУЛИРОВАННЫЙ КОРМОВОЙ

Технические условия

Microgranular fodder vitamin E (α-tocopherol acetate). Specifications

ГОСТ 27547-87

(CT СЭВ 4800-87)

СОДЕРЖАНИЕ

1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

2. ПРИЕМКА

3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ

4. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

Дата введения 01.01.89

Настоящий стандарт распространяется на витамин Е (α-токоферола ацетат) микрогранулированный кормовой, предназначенный для производства премиксов, используемых для введения в комбикорма с целью обеспечения потребности сельскохозяйственных животных в витамине Е.

1.1. Микрогранулированный кормовой витамин Е должен изготовляться в соответствии с требованиями настоящего стандарта по технологическому регламенту, утвержденному в установленном порядке.

1.2. Характеристики

1.2.1. По физико-химическим и органолептическим показателям микрогранулированный кормовой витамин Е должен соответствовать требованиям, указанным в таблице.

Наименование показателя	Значение и характеристика
1. Внешний вид	Однородный сыпучий порошок, состоящий из микрогранул
2. Цвет	От светло-желтого с сероватым оттенком до коричневого цвета
3. Запах	Без запаха
4. Подлинность.	Появление красно-оранжевого окрашивания при проведении качественной реакции с ортофенантролином и хлорным железом
5. Остаток на сите с отверстиями диаметром 0,5 мм, %, не более	5
6. Потеря в массе при высушивании, %, не более	5
7. Массовая доля витамина Е, %	25,0 - 27,5

Примечание . Допускается уменьшение массовой доли витамина Е после 6 мес. хранения препарата, но не более чем на 10 % от значения, указанного при его изготовлении.

1.2.2. Требования безопасности

1.2.2.1. Микрогранулированный кормовой витамин Е является горючим веществом. Температура самовоспламенения 438°С.

1.2.2.2. Взвешенная пыль взрывоопасна. Нижний предел взрываемости 31 г/м3.

1.2.2.3. Микрогранулированный кормовой витамин Е относится к малотоксичным веществам.

1.2.2.4. Производственные помещения должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией. В случае нарушения герметичности технологического оборудования и попадания в рабочее помещение пыли необходимо пользоваться респиратором.

1.2.2.5. Очистку рабочих помещений от пыли проводят с помощью вакуумных установок или путем влажной уборки.

1.2.2.6. При работе с кормовым витамином Е следует соблюдать меры личной гигиены.

1.3. Маркировка

1.3.1. Каждую упаковочную единицу снабжают этикеткой, на которой указывают:

наименование министерства;

наименование предприятия-изготовителя и его товарный знак;

наименование препарата;

рекомендации по хранению;

массовую долю витамина Е, %;

массу нетто и брутто;

номер партии и дату выпуска;

обозначение настоящего стандарта;

срок годности.

1.3.2. Транспортная маркировка - по ГОСТ 14192 со следующим дополнением: на транспортную тару наносят манипуляционные знаки: «Беречь от влаги», «Беречь от нагрева».

1.4. Упаковка

1.4.1. Препарат фасуют от 10 до 15 кг в двух-, четырехслойные бумажные мешки по ГОСТ 2226 с вкладышами из полиэтиленовой пленки по ГОСТ 10354 или мешки по ГОСТ 17811. Полиэтиленовые вкладыши или мешки заваривают или завязывают шпагатом по ГОСТ 17308 или швейной хлопчатобумажной нитью по ГОСТ 6309. Верх бумажных мешков прошивают или склеивают.

1.4.2. Допускается отклонение массы нетто единицы продукции на ±1 %.

1.4.3. Каждую упаковочную единицу сопровождают указанием по применению кормового микрогранулированного витамина Е.

2.1. Правила приемки - по ГОСТ 23462.

2.2. Для контроля качества кормового микрогранулированного витамина Е отбирают 10 % упаковочных единиц, но не менее 3 единиц, если партия состоит менее чем из 30 упаковочных единиц. Если в партии 30, но не более 100 упаковочных единиц, отбирают 8 % упаковочных единиц, но не менее 5 единиц, если в партии 100 и более упаковочных единиц, отбирают 6 % упаковочных единиц, но не менее 8 единиц.

3.1. Отбор проб

3.1.1. Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

3.1.2. Из средней пробы отбирают не менее 400 г препарата, половину которого используют для испытаний, а другую половину хранят на случай разногласий в оценке качества в течение срока годности.

3.1.3. Определение внешнего вида

Около 1 г пробы, взвешенной с погрешностью не более 0,01 г, тщательно перемешивают, рассыпают тонким слоем на фильтровальной бумаге и визуально определяют внешний вид и цвет при рассеянном дневном освещении.

3.2. Определение запаха

Около 1,5 г пробы, взвешенной с погрешностью не более 0,01 г, рассыпают тонким слоем на часовом стекле диаметром 60 - 80 мм и по истечении 5 мин определяют запах на расстоянии 50 мм от пробы.

3.3. Определение подлинности

3.3.1. Сущность метода заключается в установлении идентичности полученного продукта с витамином Е по образованию окрашенного в красно-оранжевый цвет комплекса при реакции продукта с ортофенантролином и хлорным железом.

3.3.2. Оборудование и реактивы

Весы аналитические типа ВЛР-200 по ГОСТ 24104.

Чашка фарфоровая вместимостью 65 см3 по ГОСТ 9147.

Баня водяная.

Колбы конические исполнений 1, 2, вместимостью 50 см3 по ГОСТ 25336.

Пипетки измерительные исполнений 1, 2, 4, 5, 6, вместимостью 1 и 10 см3, 2-го класса точности.

Спирт этиловый абсолютированный.

Эфир этиловый для наркоза.

Железо хлорное по ГОСТ 4147, раствор массовой долей 0,2 % в абсолютированном спирте.

Ортофенантролин, раствор массовой долей 0,5 % в абсолютированном спирте.

3.3.3. Проведение испытания

0,5 г пробы, взвешенной с погрешностью не более 0,0002 г, встряхивают в конической колбе вместимостью 50 см3 с 10 см3 теплой воды в течение 10 мин, затем нагревают на водяной бане при температуре 35 - 40°С до полного разрушения гранул и охлаждают. К раствору прибавляют 10 см3 эфира, взбалтывают, отделяют эфирный слой. Эфир выпаривают в фарфоровой чашке на водяной бане. Остаток растворяют в 10 см3 абсолютированного спирта, прибавляют 1 см3 спиртового раствора ортофенантролина и 1 см3 спиртового раствора хлорного железа, в результате чего должно появиться красно-оранжевое окрашивание.

3.4. Определение остатка на сите

3.4.1. Оборудование

Весы лабораторные технические по ГОСТ 24104.

Сито из стальной проволочной сетки № 05 с поддоном.

Стакан стеклянный вместимостью 500 см3 по ГОСТ 25336.

3.4.2. Проведение испытания

100 г пробы, взвешенной в стакане с погрешностью не более 0,01 г, просеивают на сите в течение 5 мин. Остаток на сите переносят в стакан и взвешивают с той же погрешностью.

3.4.3. Обработка результатов

Остаток на сите ( X ) в процентах вычисляют по формуле:

где т1 - масса стакана с остатком пробы после просеивания, г;

т2- масса пустого стакана, г;

т - масса пробы, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,2 %.

3.5. Определение потери в массе при высушивании

3.5.1. Оборудование

Весы аналитические типа ВЛР-200 по ГОСТ 24104.

Шкаф сушильный лабораторный электрический с терморегулятором марок СЭШ-1, СЭШ-3М или других марок.

Эксикатор стеклянный по ГОСТ 25336.

Бюксы стеклянные вместимостью 30 см3 по ГОСТ 25336.

3.5.2. Проведение испытания

5 г пробы взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г в бюксе, предварительно высушенной до постоянной массы. Бюксу с пробкой помещают в сушильный шкаф и выдерживают при температуре 100 - 105°С до постоянной массы, затем охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

3.5.3. Обработка результатов

Потерю в массе при высушивании (Х1) в процентах вычисляют по формуле:

где т3- масса пробы до высушивания, г;

т4 - масса пробы после высушивания, г.

3.6. Определение массовой доли витамина Е (α-токоферола ацетат)

3.6.1. Сущность метода заключается в образовании окрашенного в красно-оранжевый цвет комплекса при реакции витамина Е с ортофенантролином и хлорным железом и фотометрическим измерении оптической плотности раствора при длине волны 520 нм.

3.6.2. Оборудование, материалы и реактивы

Весы аналитические типа ВЛР-200 по ГОСТ 24104.

Фотоэлектроколориметр марки ФЭК-56М или спектрофотометр марки СФ-16 или других аналогичных марок.

Баня водяная.

Испаритель ротационный ИР-1М или другого типа.

Воронка делительная вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.

Колбы мерные вместимостью 25 и 100 см3 по ГОСТ 1770.

Колбы конические вместимостью 100 см3 по ГОСТ 25336.

Колба круглодонная вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336.

Цилиндр измерительный вместимостью 50 см3 по ГОСТ 25336.

Холодильник стеклянный по ГОСТ 25336.

Фильтр бумажный.

Ортофенантролин, раствор массовой долей 0,5 % в абсолютированном спирте.

Железо хлорное по ГОСТ 4147, раствор массовой долей 0,2 % в абсолютированном спирте.

Спирт этиловый абсолютированный.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

α-токоферола ацетат - стандарт.

Калия гидрат окиси по ГОСТ 9285, раствор массовой долей 50 %.

Кислота аскорбиновая.

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166, х.ч.

Фенолфталеин по НТД, спиртовый раствор массовой долей 1 %.

Эфир для наркоза.

3.6.3. Подготовка к испытанию

0,1 г α -токоферола ацетат, взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, прибавляют 30 см3 ректификованного спирта, 3 см3 раствора гидроокиси калия, 0,1 г аскорбиновой кислоты и нагревают с обратным холодильником при температуре кипения смеси на водяной бане в течение 30 мин. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в делительную воронку 50 см3 воды и экстрагируют эфиром один раз 50 см3 эфира и два раза по 30 см3. Объединенный экстракт промывают водой порциями по 30 см3 до исчезновения щелочной реакции промывных вод (проба с фенолфталеином). К экстракту прибавляют 8 г безводного сернокислого натрия и оставляют в защищенном от света месте на 30 мин, периодически перемешивая. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 250 см3. Допускается медленное фильтрование экстракта через бумажный фильтр, на который помещено около 8 г безводного сернокислого натрия. Сернокислый натрий промывают три раза эфиром порциями по 20 см3, сливая раствор в ту же колбу. Эфир отгоняют на водяной бане при температуре не выше 40°С в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе при температуре не выше 20°С.

Сухой остаток тотчас растворяют в абсолютированном спирте, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят объем раствора абсолютированным спиртом до метки и перемешивают. 1 см3 полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают. Из полученного раствора отбирают последовательно 1, 2, 3, 4, 5, 6 см3 в мерные колбы вместимостью 25 см3, прибавляют 1 см3 раствора ортофенантролина, 1 см3 раствора хлорного железа, доводят объем раствора абсолютированным спиртом до метки, перемешивают и оставляют в защищенном от света месте. Точно через 10 мин после прибавления спиртового раствора хлорного железа измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны (520 ±2) нм или на фотоэлектроколориметре при длине волны около 520 нм. В качестве раствора сравнения применяют абсолютированный спирт. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения витамина Е.

Строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, а на оси абсцисс - соответствующие значения концентрации витамина Е в миллиграммах в 25 см3 раствора.

3.6.4. Проведение испытания

0,4 г пробы, взвешенной с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см3, прибавляют 10 см3 воды, предварительно подогретой до (65 ±5)°С, и перемешивают до полного разрушения гранул. Прибавляют 30 см3 ректификованного спирта, 3 см3 раствора гидроокиси калия, 0,1 г аскорбиновой кислоты и далее проводят испытание, как указано в п. 3.6.3, до получения сухого остатка. Сухой остаток растворяют в абсолютированном спирте, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки тем же спиртом: 2 см3 полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3 и доводят объем раствора тем же спиртом до метки. 2 см3 раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, прибавляют 1 см3 спиртового раствора ортофенантролина, 1 см3 спиртового раствора хлорного железа, доводят объем раствора абсолютированным спиртом до метки, перемешивают и оставляют в защищенном от света месте. Точно через 10 мин после прибавления спиртового раствора хлорного железа измеряют оптическую плотность, как указано в п. 3.6.3. Из величины оптической плотности испытуемого раствора вычитают величину оптической плотности контрольного испытания.

3.6.5. Обработка результатов

Массовую долю витамина Е (Х2) в процентах вычисляют по формуле:

где С - количество витамина Е, найденное по градуировочному графику, мг в 25 см3 раствора;

100, 25, 2, 2 - объем разведений, см3;

т5 - масса пробы, взятая для анализа, г.

4.1. Продукт транспортируют всеми видами транспорта в крытых транспортных средствах.

4.2. Препарат хранят в помещении, в сухом защищенном от света месте при температуре не выше 30°С.

4.3. Срок годности препарата - 1 год со дня его изготовления.

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Минмедбиопромом СССР

РАЗРАБОТЧИКИ

И.А. Солунина, Л.А. Кузнецова

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 24.12.87 № 4885

3. Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 4800-87

4. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка	Номер пункта, подпункта
ГОСТ 1770-74	3.6.2
ГОСТ 2226-88	1.4.1
ГОСТ 4147-74	3.3.2; 3.6.2
ГОСТ 4166-76	3.6.2
ГОСТ 5962-67	3.6.2
ГОСТ 6309-93	1.4.1
ГОСТ 9147-80	3.3.2
ГОСТ 9285-78	3.6.2
ГОСТ 10354-82	1.4.1
ГОСТ 13496.0-80	3.1.1
ГОСТ 14192-96	1.3.2
ГОСТ 17308-88	1.4.1
ГОСТ 17811-78	1.4.1
ГОСТ 23462-95	2.1
ГОСТ 24104-88	3.3.2; 3.4.1; 3.5.1; 3.6.2
ГОСТ 25336-82	3.3.2; 3.4.1; 3.5.1; 3.6.2